流感病毒的分子诊断技术进展

天津市北辰区疾病预防控制中心（300400）赵永胜

流感(Influenza)是呈全球分布的传染病，各个国家都有不同程度的发生，其发病率和造成的死亡人数至今仍列传染病之首。流感也威胁着多种家畜、家禽甚至很多珍稀野生动物的繁衍和生存，对各国经济造成极大的影响[1]。流感病毒属于正黏液病毒科，是常见的呼吸道病毒，其基因组为分片段的单股负链RNA。根据其核蛋白的抗原性，可将人流感病毒分为甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)等3类。根据其核蛋白和基质蛋白的不同，将流感病毒共分4个属，其中甲型流感病毒又可根据病毒粒子血凝素和神经氨酸酶抗原性的不同分为不同的亚型[2]。甲型流感病毒经呼吸道由飞沫传播，传播迅速，潜伏期短，曾多次引起世界性大流行。乙型和丙型流感病毒只感染人类，多引起局部流行，丙型流感病毒并不会引起严重的疾病，常散发出现。近年来流感的频频发生，更是直接威胁人类生命，所以建立对流感病毒方便 、快速、准确的检测方法，对于流感患者的临床诊断和及时有效的治疗具有重大的意义。早期的血清学和免疫学等诊断方法由于其耗时长、灵敏度低、程序复杂等缺陷逐渐被更精确更快速的分子生物学诊断所替代，本文就目前流感病毒的分子生物学诊断技术进展综述如下。

1 聚合酶链反应

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一项在短时间内大量扩增特定DNA片段的分子生物学技术。PCR用于病原体的确定，可检测早期感染的病人，至少比病毒分离方法敏感500倍，但一般PCR易污染。基于一般PCR原理的基础上，先后建立了多种PCR 相关检测方法，如RT-PCR[3]、多重RT-PCR、荧光定量PCR等。RT-PCR具有敏感性高、特异性强、所需抗原量相对较少等优点。多重RT-PCR方法可以同时检测样品中可能存在的病毒，具有高效性、系统性、经济性。由于在反应中加入多种引物，这就需要摸索最佳反应条件，选择的引物之间必须互不干扰，更不能产生交互效应。多重RT-PCR可以同时检测不同病毒的这种优势补偿了其反应的敏感性比 RT-PCR略低的缺点。目前唯一经美国食品药品监督管理局(FDA)批准的甲型流感病毒快检试剂盒就是依靠多重RT-PCR方法实现的。荧光定量PCR分子诊断技术，是在病毒检测RT-PCR基础上，利用PCR对DNA的高效扩增，探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性以及定量的特点，具有直观，重复性好，特异性强，敏感性高和易操作等优点。实时RT-PCR具有特异性强，有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点，且具有高重现性、定量性。张鹏超等[4]建立的猪流感病毒SYBR Green I定量RT-PCR检测方法，对猪流感病毒核酸检测灵敏度达到30TCID50。

2 依赖核酸序列的扩增法(NASBA)

依赖核酸序列的扩增技术(nucleic acid sequence based amplification，NASBA)是一项以RNA为模板的快速等温电化学发光检测技术，这项技术检测的样品无需特殊处理，在恒定的温度条件下即可直接扩增单链RNA。该技术的特点是操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环，能在4～6h完成整个核苷酸的分离、扩增和检测，但其要求对引物的选择进行优化。

3 环介导等温扩增法(LAMP)

LAMP是一种新颖的恒温核酸扩增方法，其原理是针对靶基因个别区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。刘中勇等[5]运用相似的技术建立H3亚型流感病毒的RT-LAMP检测方法。LAMP对于流感病毒的检测具有恒温、快速、高效、高特异性等特点。

4 焦磷酸测序法

焦磷酸测序技术是由Nyren等于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术，是针对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量、高精确度(99%精确)和再现性好的分析技术。焦磷酸测序技术已被用于基因分型、疾病基因测序、DNA测序与二级结构分析。

5 基因芯片技术

基因芯片技术[6]是指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，包括cDNA芯片、寡核苷酸芯片、DNA芯片，主要用于DNA序列测定，基因表达图谱鉴定、基因突变体检测分析，基因组功能研究。夏骏等[7]通过实验证明该方法具有较高的灵敏度和特异性，但这种方法对实验条件要求较高，价格昂贵，不方便一般实验室的检测。基因芯片具有准确、快速、高通量等特点，在疾病诊断和病毒的快速检测中具有广泛地应用前景。

随着分子生物学的发展，应用于流感病毒基因检测的新技术会层出不穷，除了文章介绍的几种技术外，还有原位杂交技术等。在临床流感防控工作中，各个实验室可根据具体的条件来选择适合各自的诊断方法，发挥各自的优点，只有这样才能提高工作效率和得到好的效果，必将在流感的预防、监测和控制中发挥更为积极和重要的作用。相信随着各国科研工作者的不懈努力，在不久的将来会研制出更加有效的流感病毒分子诊断检测方法。