侵袭性曲霉病的分子诊断技术进展

天津市北辰区疾病预防控制中心（300400）赵凤仙

曲霉是自然界中普遍存在的空气播散性腐物寄生菌，最常见的是烟曲霉、黄曲霉及黑曲霉，焦曲霉和土曲霉较少见。这些真菌，尤其是烟曲霉，能引起严重的后果并危及生命。近几年来，随着医学的发展，各种疾病的治疗手段不断创新，如造血干细胞移植术、器官移植术、肿瘤化疗术的广泛开展，广谱抗生素、糖皮质激素及免疫抑制剂的广泛应用，致使由曲霉菌感染所致的侵袭性曲霉病(IA)发病率逐渐增多。由于缺乏特征性临床症状和影像学指征，微生物学检验如真菌培养的敏感性很低，组织病检属于有创操作，很多危重患者、免疫功能低下、全血细胞减少的患者对其耐受性差，且组织病检耗时长、阳性率低，对于病情进展迅速的IA早期诊断价值有限[1]，IA的诊断仍旧困难，多数IA往往死后才能确诊[2][3]。随着分子生物学技术的迅速发展，推动了侵袭性曲霉病分子诊断技术的发展。分子诊断技术具有特异性和敏感性高、快速等优点。本文就侵袭性曲霉病的分子诊断技术进展进行综述。

1 聚合酶链反应(PCR)

聚合酶链反应(p o l y m e r a s e c h a i n reaction，PCR)法作为无创性的检测方法，近年来已成为IA早期诊断上的研究热点。PCR法是一种快速、敏感性高的诊断手段，不仅可以在短时间内检测到微量曲霉菌的DNA，而且可以鉴别曲霉菌的种类。但该技术目前还没有纳入欧洲癌症/真菌感染研究和治疗工作小组2008年诊断标准，没有相关指南推荐，以及其本身缺乏标准化，阻碍了其自身的发展。但近年的一些研究让人们看到PCR法的价值。目前有商品化试剂盒可提取真菌DNA，方便、快速。随着DNA自动化提取技术的发展，可以排除真空泵、离心机和其他手工步骤对标本的交叉污染，降低PCR反应的假阳性。另外，抽提DNA时所用标本量对于PCR检测结果也有一定影响。已报道的PCR法诊断IA的敏感性和特异性差异较大，可能是与各研究者所用PCR法的样本种类、引物、核酸抽提方法和检测体系不同有关。有研究者发现PCR的敏感性比抗原检测差[4]。

2 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。金欣[5]等利用LightCycler仪器建立了一种简便、特异的实时荧光定量PCR检测方法，用于系统性曲霉感染的快速检测。通过微机控制，实现了对PCR扩增产物的实时动态监测和结果自动分析，不需要对PCR产物进行后续处理，还做了相应的溶解曲线，根据标本溶解曲线有无峰及峰的位置可判断标本有无特异性扩增，从而克服PCR可能有假阳性结果的缺点；并且证实了他们建立的PCR体系有良好的特异性和敏感性，其烟曲霉DNA检测下限可达到10fg。斑点杂交是将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜上，然后用标记探针与之杂交。用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简便、快速、灵敏、样品量少。其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。同一种标本经不同倍数的稀释，还可以得到半定量的结果，所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法。王莉等[6]通过PCR扩增曲霉28S rRNA保守序列，结合4种标记biotin的曲霉种特异性探针进行斑点杂交，成功鉴定临床常见的曲霉，并可能检测到这4种真菌的混合感染，具有很好的应用前景。

3 DNA芯片技术

该技术是用免疫荧光标记的待测样品与有规律地固定在芯片片基上的大量探针按碱基配对原则进行杂交。其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化。将不同属种真菌的特异性DNA标记后制成DNA芯片，将致病真菌DNA与DNA芯片杂交就可得到属种特异性图谱，通过这种图谱的比较和分析，就可得出致病菌的DNA信息，进而可对其进行鉴定。

4 基因探针技术

基因探针技术结合了酶切图谱法和分子杂交法，原理是应用一段带有标记的特异性核苷酸序列，通过杂交检测与探针互补的DNA或RNA片段。基因探针技术与其他一些分子生物学技术(如IPCR技术)结合，可以具有很高的敏感性。常用的探针基因组DNA探针，cDNA探针，寡核苷酸探针，RNA探针。常用的标记物为放射性核素和非放射性核素如生物素、荧光素、抗原及抗体等。由于DNA探针从DNA水平上检测病原微生物，不受其纯度的影响，能直接用于标本检测，从而解决不易培养的微生物的鉴定问题。同时，它又能在一张滤膜上进行多个样品的检测，缩短了大量样品检测的时间。

尽管分子诊断技术在侵袭性真菌感染诊断中具有明显的优势，但目前尚无法取代传统的诊断技术。不同实验室PCR检测的具体方法并不一致。IFD诊断仍是一个困扰临床医生的问题。随着科技的进步，侵袭性曲霉病的分子诊断技术的方法将不断完善更新，并逐渐向快速、敏感、特异的目标发展，它们的快速发展让我们对侵袭性曲霉病的早期诊断充满期待。