miRNA与乳腺癌他莫昔芬耐药的相关研究进展

胡宏荣综述 廖瑜倩审校

乳腺癌是威胁女性生命健康的常见恶性肿瘤，其中激素受体阳性乳腺癌患者需要内分泌治疗，他莫昔芬(tamoxifen，TAM)是目前最常用的内分泌治疗药物，但内分泌耐药的出现限制了他莫昔芬的疗效，如何改变他莫昔芬耐药已经成为临床上一个亟待解决的问题。近年来有关微小RNA(microRNA，miRNA)的研究已成为热点，miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA，它能与信使RNA(mRNA)特异结合，引起靶mRNA的降解或翻译抑制，从而在转录后对基因表达进行调控，其涉及细胞分化、生长、凋亡、代谢等多方面。相关研究发现乳腺癌中存在多种miRNA表达异常，miRNA在乳腺癌中间接地起着促癌基因和抑癌基因的功能，并在乳腺肿瘤的发生和发展中起了重要的作用。还有研究发现改变乳腺癌细胞中的miRNA表达可以影响肿瘤对药物的敏感性，甚至逆转肿瘤耐药。本文就乳腺癌中的miRNA与他莫昔芬耐药的相关研究进展进行综述。

1 miRNA与乳腺癌

随着大量有关乳腺癌细胞系和临床样本中miRNA研究的开展，以及新一代高通量检测技术和生物信息学分析方法的运用，miRNA和乳腺癌之间的关系得以逐渐呈现。相关研究的不断深入，使得人们对于乳腺癌与miRNA的认识也在不断更新，其中包括乳腺癌分子基础、分子分型的工具，诊断及预后的新标志物、鉴别诱导形成乳腺癌的新基因等。

Iorio等利用微阵列技术首次发现，与正常乳腺组织相比，乳腺癌组织中miRNA表达总体是下降的，并且其中有29种miRNA存在差异性表达。在这些miRNA中mir-125b，mir-145，mir-21和mir-155下降最明显，最后指出miRNA与乳腺癌组织病理学特征，如雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)表达、肿瘤分期、血管浸润和增殖指数等相关［1］。Seongho等利用 Illumina-Solexa深度测序平台检测技术，发现在乳腺癌细胞株中有189种明显异常的miRNA，并且这些miRNA均有不同程度的致癌潜能［2］。这些研究说明miRNA表达异常是乳腺癌的一个重要特征，同时也被认为是乳腺癌分类和预测的一种重要的和潜在的工具。

2 miRNA与他莫昔芬耐药

我们知道ER在将近70%的乳腺癌中存在高表达，并且在乳腺癌的发生发展过程中起着重要作用［3］。选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen-receptor modulator，SERM)他莫昔芬的临床应用，延长了早期乳腺癌患者的生存时间，同时提高了晚期患者的生活质量［4］。耐药是乳腺癌内分泌治疗中常见的临床问题，其中由于原发性或获得性耐药而出现复发的患者占很大的比例［5］。目前他莫昔芬耐药机制并未完全明确，通常认为乳腺癌细胞在他莫昔芬的选择作用压力下逐渐形成耐药，其中可能涉及:ER、共同调控因子、酪氨酸激酶受体信号通路、细胞周期调节因子，细胞存活通路及细胞凋亡的改变等［6-7］，同时耐药相关机制涉及细胞内基因调控的多个水平，包括转录前、转录及转录后水平。

Huber等通过下一代基因测序方法和生物信息学模型比较他莫昔芬敏感和耐药的乳腺癌细胞的转录组，发现有1215种mRNA和513种小RNA转录本的不同表达，主要集中在ERα功能、细胞周期调节、转录翻译和线粒体功能障碍［8］。Lau等研究了在他莫昔芬敏感的ZR75和耐药的AK47乳腺癌细胞系中超过600种miRNA的表达谱，发现在他莫昔芬耐药的细胞系中，总共有65种miRNA下调，同时44种miRNA上调［9］。Nam等对乳腺癌(他莫昔芬和氟维司群)耐药细胞和敏感细胞中miRNA表达谱、miRNA与靶mRNA的关系和miRNA上游调节因子等进行了综合分析，利用生物信息学方法构建了综合网络模型，发现其中 mir-221/222，mir-146a，mir-27a，mir-145，mir-21，mir-155，mir-15a，mir-125b 和 let-7s在抗雌激素耐药中起作用［10］。通过比较乳腺癌他莫昔芬耐药细胞和敏感细胞中miRNA的表达，可以发现miRNA可能在他莫昔芬耐药形成过程中起重要作用。

miRNA广泛参与细胞中的各项生理活动，其中就包括激素调节，而激素调节相关miRNA的研究，可以在乳腺癌内分泌耐药研究与miRNA研究之间提供交汇点，这为证明miRNA能够调节内分泌耐药提供了更多的支持。Manavalan等用4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen，4-OHT)处理内分泌敏感(MCF-7)和耐药(LY2)的乳腺癌细胞，采用微阵列技术发现两种细胞中有97种miRNA存在不同程度的表达，其中12种miRNA呈相反的表达，进一步研究发现其中mir-21和mir-181a在MCF-7细胞中是被雌二醇(estradiol，E2)调节。作者运用生物信息学方法分析评价具有生物学意义的miRNA并预测其靶基因，最后指出这些miRNA与内分泌耐药相关［11］。

3 乳腺癌中与他莫昔芬耐药相关的miRNA及作用机制

上述研究通过比较他莫昔芬敏感与耐药细胞，运用微阵列技术进行细胞间miRNA表达谱的检测分析，相关结果提示在乳腺癌他莫昔芬耐药形成过程中有多种miRNA参与，而这些miRNA涉及的功能并不完全相同，甚至有些相关功能截然相反，而这与miRNA调节涉及的具体机制有关。下面我们就在他莫昔芬耐药研究中涉及到的一些miRNA及相应作用机制做简要介绍，其中包括ER表达调控、上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)形成，细胞凋亡阻滞及其它作用机制等。但需要指出的是这些miRNA并不是只在某一方面起作用，例如某一种miRNA可能既调节ER表达又阻滞细胞凋亡，这也显示出miRNA功能与他莫昔芬耐药形成之间的复杂性。

3.1 mir-221/222

Zhao等发现在ERα阴性乳腺癌细胞系和人类乳腺肿瘤中，mir-221/222水平比ERα阳性要高，在ERα的3＇UTR中有2个mir-221和-222种子元件。在ERα阳性MCF-7和T47D细胞中mir-221和-222异位表达能够抑制ERα蛋白表达，但不抑制mRNA表达，这显然有助于细胞对他莫昔芬产生耐药。相比，在ER阴性MDA-MB-468细胞中敲除mir-221和-222可以部分恢复ERα蛋白表达和增加他莫昔芬介导的凋亡［12］。这些结果提示mir-221和-222在调节ERα表达中至关重要，并且可能在部分乳腺癌中作为恢复ERα表达及对内分泌治疗反应的潜在靶点。

Miller等研究miRNA在乳腺癌他莫昔芬获得性耐药中的作用，利用微阵列分析比较他莫昔芬耐药和敏感MCF-7细胞的miRNA谱，发现与他莫昔芬敏感的细胞相比，在耐药细胞中有8种miRNA呈明显上调，7种miRNA呈显著下调［13］。HER2/neu阳性的原发乳腺癌对内分泌治疗耐药，与HER2/neu阴性的样本相比较，HER2/neu阳性乳腺癌组织中mir-221和-222表达水平存在明显提高［13］。mir-221/222的异位表达能使亲本的MCF-7细胞对他莫昔芬耐药。一个已知的mir-221/222靶点，细胞周期依赖激酶抑制物1B的蛋白水平在他莫昔芬耐药的细胞中下降达到了50%，在mir-221/222过表达的他莫昔芬耐药细胞中则达到28%～50%。在对他莫昔芬原发耐药乳腺肿瘤的研究中，这是第一份证实mir-221/222表达和HER2/neu过表达相关的研究。

3.2 mir-342

Cittelly发现mir-342在乳腺肿瘤样本和他莫昔芬耐药的细胞中明显下降。恢复耐药MCF-7细胞中mir-342的表达，可使耐药细胞对他莫昔芬介导的凋亡敏感。除了促凋亡作用，生物信息学方法分析显示mir-342可以通过细胞周期蛋白B1抑制物、多种BRCA1激活物，p53细胞周期检测点功能活性等影响细胞周期的多个阶段。这就提示mir-342可以调节与他莫昔芬介导肿细胞凋亡和细胞周期进程相关的基因表达［14］。另外He等发现在MCF-7细胞中mir-342过表达可上调ER mRNA表达水平，同时增加对他莫昔芬介导的细胞凋亡和增殖抑制的敏感性［15］。

3.3 Let-7

Zhao等发现let-7在乳腺癌组织样本中是呈现下降的，其中let-7b和let-7i水平与ERα36水平呈负相关，生物信息学分析提示ERα36可能是let-7的靶点。作者为验证这一假设向MCF-7细胞中转染let-7模拟物和抑制物，发现let-7模拟物可以抑制ERα36 mRNA和蛋白表达，let-7抑制物可以促进其表达。而这种负性相关在他莫昔芬耐药细胞中同样存在，向他莫昔芬耐药MCF-7细胞中转染let-7模拟物，能够下调耐药细胞中ERα36表达，在无雌激素作用的环境下增强MCF-7细胞对他莫昔芬的敏感性。向MCF-7细胞导入无3＇UTR结构的ERα36使其过表达，则能够恢复耐药［16］。因此let-7可以通过ERα36来调节雌激素信号通路和他莫昔芬耐药。

3.4 mir-200

Manavalan等对mir-200家族成员在内分泌敏感乳腺癌细胞中的作用进行研究，发现在他莫昔芬耐药乳腺癌细胞系中mir-200家族表达是下降的，mir-200与ZEB1 mRNA表达呈负相关，mir-200家族可以通过抑制转录抑制物ZEB1/2表达来调节EMT。在LY2细胞中mir-200b或mir-200c过表达可促进细胞由间质向上皮转化，同时抑制细胞迁移。mir-200b和mir-200c过表达可使LY2细胞对雌激素拮抗剂他莫昔芬介导的生长抑制作用敏感。增加mir-200b和mir-200c可使ZEB1表达下降，细胞向上皮转化并且对他莫昔芬敏感。敲除ZEB1可以增加LY2细胞对抗雌激素药物导致的细胞增殖抑制作用的敏感性［17］。因此下调mir-200b和mir-200c表达被认为是有助于乳腺癌细胞形成耐药。

3.5 mir-375

Ward A将乳腺癌细胞MCF-7连续暴露于他莫昔芬中，建立起他莫昔芬耐药模型，研究miRNA在他莫昔芬耐药形成及EMT过程中所起的作用。他莫昔芬获得性耐药细胞具有间叶细胞特征并表现出更强的侵袭性。全miRNA表达分析显示在他莫昔芬耐药细胞中mir-375表达下降幅度最大，恢复mir-375表达能够使耐药细胞对他莫昔芬敏感并且部分逆转EMT。异粘蛋白(metadherin，MTDH)是mir-375的直接靶点，敲除MTDH基因可以部分模拟mir-375增加、耐药细胞恢复对他莫昔芬敏感性和逆转EMT等效应。另外，作者还发现在原发乳腺癌组织的临床样本中mir-375表达与MTDH呈负相关，在接受他莫昔芬治疗的患者中，MTDH高表达患者的无病生存时间更短，并且有更高的复发风险［18］。

3.6 mir-519a

Ward等发现mir-519a在他莫昔芬耐药乳腺癌细胞中表达上调，运用获得缺失功能性实验证实mir-519能够调节他莫昔芬耐药，并运用生物信息学方法发现在PI3K信号通路和细胞周期网络中存在3个mir-519的靶基因，并且这3个靶基因都是肿瘤抑制基因。mir-519在ER阳性乳腺癌细胞中增加细胞生存能力、促进细胞周期进程，并且抵抗由他莫昔芬介导细胞凋亡。最后指出mir-519与靶基因表达呈负相关，在较差预后的ER阳性乳腺癌患者中mir-519呈现高表达［19］。

3.7 mir-15a/16

Bergamaschi等发现HER2的异构体HER2 Delta16，它在ER阳性乳腺肿瘤中表达＞30%，能够促进他莫昔芬耐药和异种移植肿瘤细胞MCF-7对雌激素非依赖性。HER2 Delta16阳性细胞逃脱他莫昔芬作用，主要是通过上调BCL-2来实现，而抑制BCL-2表达或运用BCL-2抑制剂ABT-737处理MCF-7/HER2 Delta16细胞可恢复其对他莫昔芬的敏感性。进一步研究发现HER2 Delta16表达能抑制靶向BCL-2的mir-15a和mir-16，重新导入miR-15a/16将使由他莫昔芬介导的BCL-2表达下调，使MCF-7/HER2 Delta16对他莫昔芬敏感。抑制mir-15a/16表达能使BCL-2表达上调并且促进他莫昔芬耐药［20］。这可能为他莫昔芬耐药乳腺癌提供一种新的治疗干预方式。

3.8 mir-181b

Lu等发现在他莫昔芬耐药的MCF-7细胞中mir-181b，mir-221和mir-222明显过表达，将反义mir-222或-181b和他莫昔芬一同处理移植了他莫昔芬耐药肿瘤的小鼠，发现可通过mir-181b，mir-221和mir-222共同的靶点金属蛋白酶组织抑制剂3(metalloproteinase inhibitor 3，TIMP3)来抑制肿瘤生长。下调TIMP3可缓解其对解聚素和金属蛋白酶域结合蛋白10(a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10，ADAM10)的抑制效应，促进他莫昔芬耐药细胞的生长，而ADAM10对于他莫昔芬耐药细胞生长是必不可少的。作者还指出TIMP3和miRNA可能调节EGF介导的MAPK和AKT磷酸化［21］。基于这些结果作者提出mir-221，mir-222和mir-181b可以下调他莫昔芬耐药乳腺癌细胞中的TIMP3，增强生长因子信号通路。利用相应的反义miRNA可以逆转肿瘤对他莫昔芬的耐药。

3.9 mir-451

Frasor等发现他莫昔芬可以上调14-3-3家庭成员保守蛋白14-3-3ζ的表达，并且这种表达上调与早期疾病复发相关［22］。深入研究显示他莫昔芬能够上调14-3-3ζ是因为他莫昔芬能迅速下调 mir-451，而 mir-451 能够靶向 14-3-3ζ mRNA［23］。Bergamaschi等研究发现增加乳腺癌细胞中mir-451表达可下调14-3-3ζ水平，降低HER2，EGFR和MAPK信号转导，抑制细胞增殖、克隆形成、增加凋亡，最后明显恢复他莫昔芬对内分泌耐药细胞的生长抑制效应［24］。

总之，目前miRNA与乳腺癌他莫昔芬耐药的研究仍处于早期阶段，由于miRNA在调控基因表达上的复杂性，我们对miRNA在他莫昔芬耐药形成过程的作用及机制的认识仍不完整，但随着新的检测技术和更加合理的分析方法的运用，相信miRNA在可预见的未来能够帮助我们更好地了解乳腺癌中他莫昔芬耐药是如何形成的。现有的研究已经证明miRNA与他莫昔芬治疗激素受体阳性乳腺癌中的疗效相关，相关实验研究也证实通过改变耐药细胞中miRNA表达可以影响乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性，但要想将miRNA用于临床实践，从而改善内分泌治疗耐药的局面，仍需要更多临床研究结果的支持。随着实验和临床研究资料的积累，相信miRNA在预测乳腺癌他莫昔芬疗效、预防耐药形成、改善内分泌治疗效果等方面会有更值得令人期待的表现。

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