鲜奶中肠出血性大肠杆菌O157∶ H7的定量PCR 检测

俞正玉， 张碧成， 张 强， 汪 伟， 何孔旺， 倪艳秀， 温立斌， 李 彬， 周 萍，张雪寒

(江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京210014)

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E. coli，EHEC)O157∶ H7 是常见的肠道致病菌，感染该菌可引起腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发症，甚至导致死亡，致死率达5% ～10%［1-2］。1982 年，Riley 等报道了由EHEC O157∶ H7 引起的出血性结肠炎的暴发流行，这也是把EHEC O157∶ H7 确认为严重致病菌的首次报道［3］。随后在加拿大、日本、英国、澳大利亚等地发生了多起该菌的感染流行［4］。1999年，在中国安徽、江苏两省曾暴发流行EHEC O157∶ H7 感染性腹泻，患者超过2.0 ×104人，死亡177 人，流行时间7 个月，可能是迄今为止世界上流 行 规 模 最 大 的 一 次［5］。中 国 已 将 EHEC O157∶ H7 列为21 世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12 种病原微生物之一。

奶牛场是EHEC O157∶ H7主要存在场所之一，动物排泄物极易污染鲜奶。随着生活水平的提高和饮食结构的改变，国民对鲜奶和奶制品的需求量逐年增加，加强对奶制品中EHEC O157∶ H7监测势在必行。目前检测EHEC O157∶ H7的国标方法仍然以常规的平板培养和细菌分离为主。近年来，以不同基因为检测靶标的PCR、定量PCR 技术层出不穷，也不乏高通量的基因芯片技术、生物传感器技术、夹心ELISA、乳胶凝集检测方法等，这些检测技术各有优势，同时也存在种种缺陷，诸如操作复杂、费时、仪器要求高、灵敏度或特异性不强等缺点［6-9］。PCR 是一种既简便又易于掌握的方法，也被广泛应用到EHEC O157∶ H7 的快速诊断中，但假阳性和PCR 污染等弊端仍然无法避免。而荧光定量PCR方法技术则是在普通PCR 技术的基础上，在扩增反应体系中加入特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR 检测仪来检测靶标核苷酸。该技术除了具有普通PCR 的优点外，还具有更多优点:特异性更高，灵敏性更高;全封闭反应，无需PCR 产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性;可实现单管双检或多检;不接触有毒试剂，操作简单;有利于规模化、自动化。

我们在前期研究中分析了EHEC O157∶ H7全基因组序列，发现Z0372 基因只存在于EHEC O157∶ H7基因组中，为标签性基因。因此，本研究选用EHEC O157∶ H7参考菌株EDL933、非EHEC O157 菌株和肠道菌株沙门氏菌、志贺氏菌等，建立以Z0372 基因为检测靶基因的定量PCR，区分检测类似病原菌，并进一步用于鲜奶样品监测，为研制新型EHEC O157∶ H7检测试剂盒奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

试验菌株有:EHEC O157∶ H7 EDL933 菌株，人源EHEC O157∶ H7菌株882364、C118、C119、C120、C121、C122、C123、C159，其他大肠杆菌O25、O26、O55、O78、O103、O111、O127、O145、O138、O139、O141、非致病性大肠杆菌K12，以及沙门氏杆菌、巴氏杆菌、粪链球菌、葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、乳酸杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌2a、普罗威登斯菌。菌种均为江苏省农业科学院兽医研究所保存。

1.2 主要试剂和仪器

主要试剂和仪器有:2 ×Premix Ex Taq、DL-2000 DNA marker、pMD18-T 载体(TaKaRa 公司)、细菌DNA 提取试剂盒(福际生物公司)、山梨醇麦康凯(Sorbitol macconkey，SMAC)培养基、肉汤培养基和新生霉素(南京助研生物公司)、anti-E.coli O157 免疫磁珠(Dynabeads 公司)、ABI 7500 定量PCR 仪。

1.3 引物设计及合成

根 据 GenBank 上 发 表 的 EHEC O157∶ H7 EDL933(登录号:AE005174)Z0372 基因序列设计引物和探针，扩增片段为119 bp。引物Z0372-F(5'-GCCAGGCAAATATGTTTGTGA-3')、Z0372-R (5'-CATTTGGCATTTGAACGATGAA-3')和Z0372-P(5'-CCTGGATACCGCTACTCAAATTCTGTCAAAAT-3')，由TaKaRa 公司合成，稀释浓度10 pmol/μl，－20 ℃保存备用。

1.4 PCR 扩增和定量用标准品的制备

用Z0372-F/R 引物对PCR 扩增Z0372 片段，按照试剂盒说明书回收扩增产物，并将PCR 产物克隆到pMD-19-T 载体，转化感受态菌株DH5a，酶切鉴定阳性质粒pTZ372，作为定量标准品备用。用蛋白质核酸定量仪测定质粒浓度，根据每个阳性质粒大小为2 799 bp 和每个阳性质粒质量为1.43 ×10－18g，制备1μl 7 ×107拷贝的质粒DNA 溶液。由于Z0372 基因在EHEC O157∶ H7基因组中是单拷贝，所以可以用质粒pTZ372 作为标准样品制作标准曲线。

1.5 实时荧光定量PCR 条件的优化

采用Taqman 探针法，在荧光定量PCR 仪上进行扩增和数据分析。以最小的Ct 值和最高的荧光值为标准，分别对退火温度、引物和探针浓度、延伸时间等进行优化。

1.6 重复性、特异性和敏感性试验

用同处理同浓度的EHEC O157∶ H7 EDL933菌株，以 及EHEC O157∶ H7 菌 株882364、C118、C119、C120、C121、C122、C123、C159，其他大肠杆菌O25、O26、O55、O78、O103、O111、O127、O145、O138、O139、O141，非致病性大肠杆菌K12，以及沙门氏杆菌、巴氏杆菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌2a 的DNA 模板进行实时定量PCR 扩增，检验其稳定性、特异性。

将方法1.4 中制备的10 倍倍比稀释后的质粒DNA 溶液(1 μl 7 ×106拷贝、7 ×105拷贝、7 ×104拷贝、7 ×103拷贝、7 ×102拷贝和7 ×101拷贝)，进行荧光定量PCR 扩增，以检验其灵敏性。

1.7 标准曲线的绘制

标准样品(质粒pTZ372)10 倍倍比稀释成1 μl 7 ×106拷贝、7 ×105拷贝、7 ×104拷贝、7 ×103拷贝、7 ×102拷贝和7 ×101拷贝的质粒DNA 溶液，定量PCR 扩增后，绘制标准曲线。

1.8 模拟阳性样品的制备

用接种环蘸取－70 ℃保存的EHEC O157∶ H7菌种，划线接种于山梨醇麦康凯平板，37 ℃培养20 h。取单个菌落接种5 ml LB 液体培养基(含新生霉素50 μg/ml)，培养20 h。取细菌培养液1 ml，12 000 r/min离心5 min，沉淀用灭菌生理盐水洗涤3 次，再用100 μl TE 缓冲液重悬。用灭菌生理盐水将EHEC O157∶ H7培养物10 倍比稀释，涂布山梨醇麦康凯琼脂平板，菌落计数。

从奶牛场采集鲜奶，用TaqMan ® EHEC O157∶ H7检测试剂盒(Applied System 公司)进行检测，选用EHEC O157∶ H7阴性鲜奶。鲜奶分装每管20 ml，依次加入不同浓度的EHEC O157∶ H7菌液，终浓度分别为3 ×106CFU/ml、3 ×105CFU/ml、3 ×104CFU/ml、3 ×103CFU/ml、3 × 102CFU/ml、3 ×101CFU/ml、3 ×100CFU/ml，震荡混匀后，取1 ml用细菌DNA 提取试剂盒提取鲜奶中细菌DNA。

1.9 鲜奶样品的检测

1.9.1 样品采集 在南京市选取3 家奶牛场采集鲜奶样品，分3 个批次采集:2014 年6 月汤山某奶牛场采集鲜奶22 份;2014 年8 月江宁某奶牛场采集鲜奶44 份;2014 年11 月浦口某奶牛场采集鲜奶24 份。

1.9.2 样品处理 取25 ml 鲜奶加入到225 ml mEC 肉汤培养基(含新生霉素50 μg/ml)，42 ℃过夜培养(18 ～20 h)。次日，取1 ml 培养物500 r/min离心10 min，取上清12 000 r/min离心5 min，沉淀用100 μl TE 重悬。用细菌DNA 提取试剂盒提取细菌DNA，即为待检模板。同时吸取1ml 培养物，进行免疫磁珠富集，涂布SMAC 平板，挑取在平板上圆形、光滑、湿润、边缘整齐、直径约1 ～2 mm 的菌落，对颜色为无色半透明的可疑大肠杆菌O157∶ H7菌落，用定量PCR 和rfbE/fliC 双重PCR［10］再鉴定。

1.9.3 测序分析 将定量PCR 和rfbE/fliC 双重PCR 鉴定阳性扩增条带送金斯瑞生物有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 定量PCR 扩增最佳条件

采用探针法，在ABI 7500 定量PCR 仪上建立25.0 μl 反应体系，以扩增效率90% ～115%、相关系数0.990 以上、无模板对照不出现非特异性扩增产物为标准［11］。引物与探针浓度比例为1∶ 1 和1∶ 2 的扩增效率差异不明显，因此确定引物探针引物比例为1∶ 1。比较3 种退火条件60 ℃30 s、62 ℃30 s 和63℃30 s，62 ℃30 s 时，无模板对照的Ct 值最大(≥35)，表明阴性对照成立，无非特异性扩增。根据上述结果确定定量PCR 体系为:2×PCR 扩增预混合溶液12.5 μl，引物Z0372-F、Z0372-R 和Z0372-P 各1.0 μl(10 pmol/μl)，模板DNA 1.0 μl，补加ddH2O 8.5 μl，总体积25.0 μl。PCR 扩增条件:95 ℃预变性10 min，95 ℃10 s，62 ℃30 s，40 个循环。

2.2 Z0372 基因荧光定量PCR 标准曲线

将10 倍倍比稀释的阳性质粒pTZ372 溶液进行定量PCR 扩增，以模板拷贝数(模板浓度)为x 轴，Ct 值为Y 轴，绘制标准曲线。标准曲线方程Y =－3.059x+38.097，相关系数0.996，标准曲线中Ct值和标准质粒浓度间呈现良好的线性关系。

2.3 荧光定量PCR 的敏感性、特异性和重复性

检测10 倍倍比稀释的阳性质粒pTZ372，1 μl 70 拷贝的质粒DNA 溶液仍有扩增曲线(Ct =30.1)(图1)。检测模拟大肠杆菌O157∶ H7阳性鲜奶样品，300 CFU/ml时仍有扩增曲线(Ct =33.5)，表明该定量PCR 方法敏感性较高。

图1 Z0372 基因荧光定量PCR 的扩增曲线Fig.1 Amplification curves of Z0372 gene by real-time PCR

以大肠杆菌O157∶ H7EDL933 为阳性对照，检测本研究所选其他菌株，所有样品在同样条件下进行PCR 扩增。结果显示所有大肠杆菌O157∶ H7菌株均有特异性扩增曲线，而其他大肠杆菌O25(Ct≥35.1)、O26 (Ct≥35.6)、O55 (Ct≥34.1)、O78 (Ct≥36.1)、O103 (Ct≥36.5)、O111 (Ct≥36.8)、O127 (Ct≥36.0)、O145 (Ct≥34.5)、O138(Ct≥37.1)、O139 (Ct≥37.7)、O141 (Ct≥37.2)，

非致病性大肠杆菌K12 (Ct≥38.6)，以及沙门氏杆菌(Ct≥37.5)、巴氏杆菌(Ct≥37.8)、痢疾志贺氏菌(Ct≥38.0)、福氏志贺氏菌2a(Ct≥37.3)均为阴性。说明该方法具有较好的特异性。

组内重复测定的变异系数(RSD)为0.27% ～1.16%，组间重复测定的变异系数(RSD)为0.31% ～1.89%，均在可接受的合理范围内，说明本研究建立的TaqMan 探针实时荧光定量PCR 方法的稳定性良好。

2.4 奶牛场鲜奶样品大肠杆菌O157∶ H7的检测

90 份鲜奶样品中，定量PCR 检测阳性样品有2个，分别为13 号(Ct 值=18.78)和79 号(Ct 值=23.98)。将阳性PCR 产物回收并送金斯瑞生物有限公司测序，结果显示PCR 产物与GenBank Z0372序列同源性为100%。

按照方法1.9.2 分离鲜奶样品中的细菌，只有79 号样分离到大肠杆菌O157∶ H7，单菌落Z0372定量PCR 和rfbE/fliC 双重PCR 鉴定均为阳性，扩增条带序列与GenBank Z0372 序列同源性为100%。

3 讨论

牛、羊、猪、鸡等家畜家禽感染EHEC O157∶ H7后，可引起腹泻，并污染畜禽的肉奶蛋制品以及水源和农作物等，给农牧业生产造成巨大损失，对人们的健康构成巨大威胁。EHEC O157∶ H7在反刍动物的流行率要显著高于其他驯养动物［12］，牛已被确认为EHEC O157∶ H7的主要宿主和传染源头，据报道母牛的感染率为27. 3%，夏季有时高达35%［13］。因此，随着国民饮食结构改变，对鲜奶和奶制品的食入量逐年增加，加强对奶制品中EHEC O157∶ H7监测势在必行。

许多检测技术选用EHEC O157∶ H7毒力相关基因，例如志贺毒素基因(stx1 和stx2)［14-15］、紧密素基因(eae)［16］以及共同具有的表型基因uidA［17］、fimA［18］、rfbE (O 抗原)和fliC (H 抗原)［11，19］，这些基因在检测靶标的检测技术中发挥着重要作用，但也具有一定的局限性。许多致病原携带有stx 和eae基因，以这些基因建立的检测技术不能直接用于EHEC O157∶ H7的鉴定;另外，选用表型基因的检测技术需要同时检测至少2 个基因才能够确定是否为EHEC O157∶ H7。随着生物信息学的快速发展，筛选病原菌特有基因建立快速检测技术有着重要的意义。Z0372 基因是我们前期通过大量的基因序列分析和比对而发现的，它唯一存在于 EHEC O157∶ H7基因组中，是EHEC O157∶ H7遗传标志性基因，建立基于该基因的检测方法将克服已有检测技术的局限性。

本研究建立的Z0372 定量PCR 检测方法可特异地检测出鲜奶中污染的EHEC O157∶ H7，敏感性高，特异性好，可以检测到70 个拷贝的Z0372 基因片段，病原菌最低检测浓度为300 CFU/ml。Shen等［20］建立了以免疫磁珠和标记纳米颗粒为载体的ELISA 方法，食物中病原菌的检测敏感性介于6.8 ×102CFU/ml和6.8 ×103CFU/ml之间。Ibekwe 等［21］建立了stx1、stx1、eae 基因和16sRNA 定量PCR，环境样品的最低检测限为6.8 ×103CFU/ml，敏感性低，并且不能直接明确是EHEC O157∶ H7。EHEC O157∶ H7在环境和食品中含量较低，但是致病力极强，几十个细菌就能够导致人类发病甚至死亡。当前EHEC O157∶ H7检测技术，均需增菌后再行检测。因牛奶中蛋白质和脂肪含量过高，为提高牛奶中病原菌的检测率，本研究以42 ℃培养选择性增菌，减少温度敏感菌的增长;同时，选用试剂盒提取细菌DNA，以代替普通煮沸方法，避免牛奶中蛋白质和脂肪对DNA 聚合酶的抑制。本研究中，非EHEC O157∶ H7菌株均未检测出阳性;在90 份奶牛场鲜奶样品中，检测到2 个阳性样品，其中只有1个鲜奶样品被成功分离到EHEC O157∶ H7。Karns等用多重PCR、定量PCR 和细菌分离法同时检测36份牛奶，定量PCR 检出阳性5 份，多重PCR 检出阳性2 份，而细菌分离法只检出1 份阳性［22］。所有研究结果表明，定量PCR 较传统细菌分离方法的敏感性高，并且可定量检测，对于评估携带病原菌样品的风险有一定的指导意义。

Z0372 基因是EHEC O157∶ H7的遗传标志性基因，是人兽共患病原菌检测的优选基因，建立快速、特异和高通量的检测技术将对防控提供有力的帮助。Wu 等通过基因芯片筛选致病性大肠杆菌K-12 和大肠杆菌O157∶ H7的差异基因，以期寻找大肠杆菌O157∶ H7的独有致病因子，但未能得到预期结果［23］。Jin 等运用基因芯片检测和鉴定大肠杆菌O157∶ H7和霍乱弧菌O139，stx1、stx2 和uidA 基因被确定为大肠杆菌O157∶ H7 的代表性基因［24］。Wolter 等建立流通式化学发光芯片同时检测大肠杆菌O157∶ H7、沙门氏杆菌和嗜肺军团菌，检测敏感性分别为3 ×103CFU/ml、3 ×106CFU/ml、1 ×105CFU/ml［25］。由此可见，选用病原菌独有的遗传标志性基因对于提高检测的灵敏度和通量具有重要意义。Z0372 基因是EHEC O157∶ H7遗传标志基因，以其为靶标的定量PCR 可以应用于临床样品EHEC O157∶ H7的检测，尤其可以作为鲜奶样品监测的有力工具。

［1］ MEAD P S. Food-related illness and death in the United States［J］. Emerging Infectious Disease，1999，5:607-625.

［2］ 张雪寒，栾晓婷，何孔旺，等. 肠出血性大肠杆菌O157∶ H7 toxB 基因的分片段克隆和表达［J］. 江苏农业学报，2014，30(6):1392-1395.

［3］ RILEY L W，REMIS R S，HELGERSON S D，et al. Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype［J］. The New England Journal of Medicine，1983，308:510-681.

［4］ SHINAGAWA K，KANEHIRA M ，OMOE K，et a1. Frequency of Shiga toxin-producing Escherichia coli in cattle at a breeding farm and at a slaughterhouse in Japan［J］. Veterinary Microbiology，2000，76(3):305-309.

［5］ 汪 华. 肠出血性大肠杆菌O157∶ H7流行特征和控制对策研究［J］. 医学研究通讯，2005，34(5):24-25.

［6］ MARCH S B，RATNAM S. Sorbitol-MacConkey medium for detection of Escherichia coli O157∶ H7 associated with hemorrhagic colitis［J］. Journal of Clinical Microbiology，1986，23:869-872.

［7］ ZADIK P M，CHAPMAN P A，SIDDONS C A. Use of tellurite for the selection of verocytotoxigenic Escherichia coli O157［J］. J Med Microbiology，1993，39:155-158.

［8］ GANNON V P，KING R K，KIM J Y，et al. Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction［J］. Applied and Environmental Microbiology，1992，58:3809-3815.

［9］ CEBULA T A，PAYNE W L，FENG P. Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157∶ H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR［J］. Journal of Clinical Microbiology，1995，33:248-250.

［10］ 李 丽，张雪寒，何孔旺，等，EHEC O157∶ H7二重PCR 的建立及应用［J］. 华北农学报，2011，26(6):1-8.

［11］ TEVFIK D M. Real-time PCR［M］.UK:Taylor ＆ Francis Group，2006:1-18.

［12］ BACH S J，MCALLISTER T A，VEIRA D M，et a1. Transmission and control of Escherichia coli O157∶ H7-A review［J］. Canadian Journal of Animal Science，2002，8(2):475-490.

［13］ GANNON V P J，GRAHAM T A，KING I T，et al. Escherichia coli O157∶ H7 infection in cows and calves in a beef cattle herd in Alberta，Canada ［J］. Epidemiology and Infection，2002，29(1):163-172.

［14］ DEISINGH A K，THOMPSON M. Strategies for the detection of Escherichia coli O157∶ H7 in foods［J］. Journal Applied Microbiology，2004，96:419-429.

［15］ GANNON V P，KING R K，KIM J Y，et al. Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction［J］. Applied and Environmental Microbiology，1992，58:3809-3815.

［16］ BARLETTA F. Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli［J］. Journal Clinical Microbiology，2009，47:1915-1917.

［17］ LI Y，MUSTAPHA A. Simultaneous detection of Escherichia coli O157∶ H7，Salmonella，and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR［J］. Journal of Food Protection，2004，67:27-33.

［18］ LI B，KOCH W H，CEBULA T A. Detection and characterization of the fimA gene of Escherichia coli O157∶ H7 ［J］. Molecular Cellular Probes，1997，1:397-406.

［19］ DESMARCHELIER P M，BILGE S S，FEGAN N，et al. A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide ［J］. Journal of Clinical Microbiology，1998，36:1801-1804.

［20］ SHEN Z，HOU N，JIN M，et al. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Escherichia coli O157∶ H7 using immunomagnetic and beacon gold nanoparticles［J］. Journal of Food Protection，2012，75(8):1373-1381.

［21］ IBEKWE A M，WATT P，GRIEVE C M，et al. Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157∶ H7 in dairy wastewater wetlands［J］. Applied and Environmental Microbiology，2002，68:4853-4862.

［22］ KARNS J S，VAN KESSE J S，MCCLUSKY B J，et al. Incidence of Escherichia coli O157∶ H7 and E. coli virulence factors in US bulk tank milk as determined by polymerase chain reaction［J］.Journal of Dairy Science，2007，90 (7):3212-3219.

［23］ WU C F，VALDES J J，BENTLEY W E，et al. DNA microarray for discrimination between pathogenic O157∶ H7 EDL933 and non-pathogenic Escherichia coli strains［J］. Biosens Bioelectron，2003，19(1):1-8.

［24］ JIN D Z，XU X J，CHEN S H，et al. Detection and identification of enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶ H7 and Vibrio cholera O139 using oligonucleotide microarray［J］. Infectious Agent Cancer，2007，23(2):1-10.

［25］ WOLTER A，NIESSNER R，SEIDEL M. Detection of Escherichia coli O157∶ H7，Salmonella typhimurium，and Legionella pneumophila in water using a flow-through chemiluminescence microarray readout system［J］. Analytical Chemistry，2008，80 (15):5854-5863.