鸡瘦素受体胞外域成熟肽重组蛋白质的表达以及多克隆抗体的制备

雷明明, 吴思谦, 李孝伟, 施振旦

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所动物品种改良和繁育重点实验室,江苏南京 210014;2.华南农业大学动物科学学院,广东广州 510642)

鸡瘦素受体胞外域成熟肽重组蛋白质的表达以及多克隆抗体的制备

雷明明1, 吴思谦2, 李孝伟2, 施振旦1

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所动物品种改良和繁育重点实验室,江苏南京 210014;2.华南农业大学动物科学学院,广东广州 510642)

根据鸡瘦素受体基因(LEPR)编码区序列(GenBank:NM_AB033383)设计并合成2对引物,以鸡肝脏cDNA为模板扩增鸡LEPR胞外域2段cDNA序列。然后将这2段序列克隆到表达载体pRSET-A的BamH I和Hind III酶切位点之间,构建重组表达载体(pR-LEPR1和pR-LEPR2)并转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。转化菌在IPTG诱导后分别表达了分子量为2.62×104的LEPR1和分子量为2.86×104的LEPR2重组蛋白质。经凝胶Ni-NTA纯化后的重组蛋白质与矿物油佐剂混合免疫生长鸡,经过3次免疫之后,获得高效价的抗LEPR1和抗LEPR2抗血清。

瘦素受体;成熟肽序列;克隆和表达;多克隆抗体

瘦素(Leptin)是由白色脂肪细胞分泌的一种多肽,在调节摄食、代谢和能量平衡方面有重要作用[1-2]。在中枢神经系统,瘦素可以抑制下丘脑神经肽Y和促进肥胖素(Orexin)的表达来抑制摄食[3]。在外周能量代谢调控中,瘦素可以通过降低血糖浓度和提高AMP激活蛋白激酶(AMPK)的活性来促进代谢[4],刺激脂肪氧化代谢和降低胰岛素样生长因子-I (IGF-I)的分泌来降低甘油三酯的浓度[5-6]。1998年Taouis等首次报道了鸡瘦素基因[7],随后Friedman-Einat等报道无法检测鸡等鸟类血清中的瘦素[8],Hen等利用瘦素信号传导细胞模型也几乎检测不到鸡血液瘦素信号[9],Pitel等报道鸡基因组缺失哺乳动物瘦素基因座位区域[10]。最近一些研究者相继报道发现了草雀、鸽子、鸭子等瘦素基因片段和基因[11-12]。2014年,日本学者Ohkubo等也报道鸡血清中可能存在瘦素[13]。尽管对鸡是否存在瘦素仍有争议,但鸡瘦素受体(Leptin receptor,LEPR)是真实存在的,并且在鸡的许多组织中表达[14-15]。

LEPR有a、b、c、d、e、f 6种不同的亚型[16],其中a、c、d、e、f这5种是短型受体,b是长型受体。这些亚型中只有长型受体LEPR-b包含了激活JAK-STAT信号传导途径所必需的一段胞质区和疏水氨基酸残基,是瘦素的重要功能性受体。鸡LEPR-b有1 148个氨基酸,在胞质区有3个保守的酪氨酸残基,分别是Tyr985、Tyr1077和Tyrl138,这3个氨基酸在LEPR激活的过程中起重要作用。2014年Lei等研究发现对生长鸡免疫LEPR胞外域后产生的抗LEPR抗体可以显著加强LEPR的信号转导,促进脂肪代谢相关基因的表达和降低脂肪合成基因的表达,导致脂肪沉积减少[17]。但是,对鸡免疫LEPR胞外域后产生的抗LEPR抗体加强LEPR信号转导的作用机理尚不清楚,需要进一步深入研究。因此,本研究旨在通过构建鸡受体胞外域蛋白融合表达载体,获得鸡瘦素受体胞外域不同区域融合蛋白,并且利用融合蛋白制备受体特异性的多克隆抗体,为研究鸡瘦素和鸡瘦素受体的生物功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

pMD18-T载体购自TaKaRa公司,E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)和pRSET-A由江苏省农业科学院畜牧研究所动物品种改良与繁育重点实验室保存。限制性内切酶BamH I和Hind III、Ex TaqDNA聚合酶、DL2000分子量标准、T4连接酶及胶回收试剂盒为TaKaRa公司产品。用于纯化的带His-tag的50%Ni-NTA凝胶(Qiagen)购自基因公司。辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG购自北京鼎国生物技术有限公司。

1.2 鸡LEPR成熟肽基因序列的克隆、重组蛋白质表达和纯化

根据鸡LEPR基因编码区的核苷酸序列(Gen-Bank:NM_204323.1)设计2对引物并由上海英骏公司合成。第1对引物在N-末端,成熟肽包含第101～300位的共200个氨基酸残基,上游引物序列为下游引物序列为第2对引物在胞外域的近膜段,成熟肽包含第582～796位上的共215个氨基酸残基,上游引物序列为下游引物序列为引物中包含有Hind III酶切位点和BamH I酶切位点。将鸡的肝脏组织cDNA作为模板,用这2对引物进行PCR扩增,分别得到1条600 bp和1条645 bp的2段LEPR,然后分别将这2段LEPR克隆插入pMD18-T载体构建重组质粒pLEPR1和pLEPR2,并将其转化入E.coliDH5α细胞株增殖复制。

抽提pLEPR1和pLEPR2质粒并用BamH I和Hind III双酶切,经凝胶电泳分离回收LEPR1和LEPR2 cDNA片段,并克隆插入表达载体pRSET-A的BamH I和Hind III两位点之间,构建pR-LEPR1和pR-LEPR2重组载体。将这2个载体转化到E. coliBL21(DE3),用IPTG诱导表达pR-LEPR1和pR-LEPR2重组蛋白质,经SDS-PAGE验证蛋白的表达和分子大小之后,用50%Ni-NTA凝胶在变性条件下进行纯化。

1.3 LEPR1和LEPR2特异性多抗的制备和纯化

将纯化并透析复性后的LEPR1和LEPR2重组蛋白质与白油混合制成含重组蛋白质1 mg/ml的油乳剂,并对生长鸡进行肌肉注射,每只注射油乳剂1 ml。间隔14 d免疫1次,共免疫3次。每次免疫前翅下静脉采血,第3次免疫后第5 d翅下静脉采血。用33%饱和硫酸氨纯化多克隆抗体,纯化得到的抗体保存于-20℃。

1.4 ELISA检测抗血清效价

将LEPR1和LEPR2抗原稀释至浓度为10 μg/ml包被96微孔酶标板,每孔加入100 μl,4℃包被过夜,次日倒掉包被液,用洗涤液(0.05%Tween+ PBS)洗3次,加5%的BSA-PBS于37℃封闭1 h,洗涤3次后依次加免疫血清、HRP羊抗鸡IgG(1∶4 000稀释),最后加底物TMB,37℃显色25 min,加2 mol/L硫酸终止反应,测定450 nm光吸收值作为抗体效价。

2 结果与分析

2.1 鸡LEPR1和LEPR2基因cDNA克隆

从鸡肝脏组织中提取总RNA,经反转录和PCR扩增后,获得2条特异条带,长度与预期的相符。经测序证明获得的序列为鸡LEPR基因cDNA序列,与GenBank中所提交的序列完全一致,包含所引入的2个酶切位点。通过双酶切和连接将鸡LEPR基因2个cDNA片段插入原核表达载体pRSET-A,获得重组的表达载体pR-LEPR1和pR-LEPR2。经过Hind III和BamH I双酶切鉴定,分别获得长度长为600 bp和645 bp的片段(图1)。

图1 鸡LEPR1和LEPR2基因的RT-PCR克隆Fig.1 The amplification of chicken LEPR1 and LEPR2 genes by RT-PCR

2.2 在E.coli BL21(DE3)中表达的鸡LEPR1和LEPR2成熟肽及其纯化

转化重组质粒pR-LEPR1和pR-LEPR2的E. coliBL21(DE3)株在LB(AMP+)液体培养基中培养并经IPTG诱导后,表达出分子量约为2.62×104的LEPR1和分子量约为2.86×104的LEPR2重组蛋白质(图2)。对2个重组蛋白质进行Western blot分析,发现转化重组质粒有免疫条带出现(图2),说明pR-LEPR1和pR-LEPR2正确表达出含有鸡LEPR的2段融合蛋白质。

图2 原核表达的鸡LEPR1和LEPR2重组蛋白质的表达以及纯化蛋白质的电泳图谱和Western blot检测图Fig.2 The expression of recombinant chicken LEPR1 and LEPR2 proteins,SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein,and Western blot analysis of the recombinant protein

2.3 ELISA检测血清抗体效价

从图3可以看出,在免疫LPER1和LEPR2重组蛋白质之后鸡血清中多克隆抗体LPER1抗体和LEPR2抗体的抗体效价(由ELISA分析的OD值代表)逐渐升高。免疫前血清中抗体效价较低,免疫2次后效价有所上升,免疫3次后效价进一步升高。

图3 免疫LEPR1、LEPR2和BSA后鸡血清中多克隆LEPR1抗体和LEPR2抗体的抗体效价Fig.3 Anti-LEPR1 and anti-LEPR2 antibody titers in chicken antiserum after immunization

2.4 抗LEPR1和LEPR2多克隆抗体的纯化

反复用33%饱和硫酸氨提纯鸡血清,收集蛋白质并进行SDS-PAGE电泳。电泳图谱出现较纯的轻链(分子量2.5×104)和重链(5.5×104)条带(图4),抗体纯度达到96%以上。用ELISA测定纯化后抗体的效价,纯化后1.2 mg/ml多克隆抗体按倍比稀释,随着抗体浓度越来越低,显色越来越浅,稀释至1∶6 400时P/N值仍大于2。

图4 纯化后多克隆抗体的SDS-PAGE图谱Fig.4 SDS-PAGE profile of purified polyclonal antibody

3 讨论

本研究克隆了鸡LEPR基因胞外域2段cDNA序列,将鸡LEPR基因胞外域2段cDNA序列插入表达质粒pRSET-A的BamH I和Hind III两酶切位点之间,表达出2个融合蛋白质。一个融合蛋白质由236个氨基酸残基组成,其N端36个残基(包括6×His的组氨酸标签)源自pRSET-A的序列,C端的200个氨基酸残基源自鸡LEPR;另一个融合蛋白质有251个氨基酸残基,同样N端36个氨基酸残基(包括6×His的组氨酸标签)源自pRSET-A的序列, C端的215个氨基酸残基源自鸡LEPR。经过多重PCR扩增、酶切和连接等,获得阅读框架正确的表达载体pR-LEPR1和pR-LEPR2。所表达的重组蛋白质可与Ni-NTA凝胶结合并被纯化,说明蛋白分子中具有来源于表达载体pRSET-A的6个连续组氨酸标签序列(His-Tag)。说明分子克隆操作和所表达的重组蛋白质分子表达的正确性,为动物免疫实验等研究工作奠定了基础。

本研究获得的多克隆抗体来自于经LEPR抗原免疫的鸡血清,这种蛋白质抗原有多个不同的抗原决定簇,为了获得特异性高的多克隆抗体需要纯度较高的抗原。抗LEPR1和抗LEPR2两种多克隆抗体的效价测定结果显示,随着免疫次数的增加,多克隆抗体效价不断升高。抗体是一种特殊分子,它不仅可以和受体结合,而且可以触发受体的信号转导,最典型的例子就是Graves病症,病人自身产生抗TSHR抗体导致甲状腺功能亢进[18-19]。以受体的胞外区蛋白质作为抗原,通过主动免疫可以不断提高抗体效价,刺激或拮抗受体信号[20]。对产蛋鸡免疫重组蛋白质LEPR1后发现抗LEPR1抗体可以显著加强LEPR的信号转导,抑制卵泡发育和降低产蛋率[21];同样对生长鸡免疫融合蛋白质LPER2后发现抗LEPR2抗体也可以显著加强LEPR的信号转导,促进脂肪代谢和抑制脂肪沉积[17]。这些研究结果表明对鸡免疫LPER蛋白质产生的抗LPER抗体加强了Leptin样物质的生物活性。抗体与受体如何作用加强LEPR信号转导的机理并不清楚,需要进一步研究。而本研究所制备的高纯度抗LEPR1和抗LEPR2两种多克隆抗体,则可以应用于研究抗体与受体间的动力学和调控脂肪代谢和繁殖性状的研究工作。

[1] PELLEYMOUNTER M A,CULLEN M J,BAKER M B,et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ ob mice[J].Science,1995,269:540-543.

[2] STOCKEBRAND M,SAUTER K,NEU A,et al.Differential regulation of AMPK activation in leptin-and creatine-deficient mice [J].The FASEB Journal,2013,27:4147-4156.

[3] KANOSKI S E,ALHADEFF A L,FORTIN S M,et al.Leptin signaling in the medial nucleus tractus solitarius reduces foodseeking and willingness to work for food[J].Neuropsychopharma-cology,2014,39:605-613.

[4] BRABANT G,MULLER G,HORN R,et al.Hepatic leptin signaling in obesity[J].The FASEB Journal,2005,19:1048-1050.

[5] ATKINSON L L,FISCHER M A,LOPASCHUK G D.Leptin activates cardiac fatty acid oxidation independent of changes in the AMP-activated protein kinase-acetyl-CoA carboxylase-malonyl-CoA axis[J].J Biol Chem,2002,277:29424-29430.

[6] LEE Y,NASEEM R H,DUPLOMB L,et al.Hyperleptinemia prevents lipotoxic cardiomyopathy in acyl CoA synthase transgenic mice[J].PNAS,2004,101:13624-13629.

[7] TAOUIS M,CHEN J W,DAVIAUD C,et al.Cloning the chicken leptin gene[J].Gene,1998,208:239-242.

[8] FRIEDMAN-EINAT M,BOSWELL T,HOREV G,et al.The chicken leptin gene:Has it been cloned?[J]Gen Comp Endocrinol,1999,115:354-363.

[9] HEN G,YOSEFI S,RONIN A,et al.Monitoring leptin activity using the chicken leptin receptor[J].J Endocrinol,2008,197: 325-333.

[10]PITEL F,FARAUT T,BRUNEAU G,et al.Is there a leptin gene in the chicken genome?Lessons from phylogenetics,bioinformatics and genomics[J].Gen Comp Endocrinol,2010,167:1-5.

[11]HUANG G,LI J,WANG H,et al.Discovery of a novel functional leptin protein(LEP)in zebra finches:evidence for the existence of an authentic avian leptin gene predominantly expressed in the brain and pituitary[J].Endocrinology,2014,155(9):3385-3396.

[12]PROKOP J W,SCHMIDT C,GASPER D,et al.Discovery of the elusive leptin in birds:identification of several′missing links′in the evolution of leptin and its receptor[J].PLoS One,2014,9 (3):e92751.

[13]OHKUBO T,HIROTA K,MURASE D E,et al.Avianblood induced intranuclear translocation of STAT3 via the chicken leptin receptor[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol,2014, 174:9-14.

[14]HOREV G,EINAT P,AHARONI T,et al.Molecular cloning and properties of the chicken leptin-receptor(CLEPR)gene[J].Mol Cell Endocrinol,2000,162:95-106.

[15]OHKUBO T,TANAKA M,NAKASHIMA K.Structure and tissue distribution of chicken leptin receptor(cOb-R)mRNA[J].Biochim Biophys Acta,2000,1491:303-308.

[16]TARTAGLIA L A.The leptin receptor[J].J Biol Chem,1997, 272:6093-6096.

[17]LEI M M,WU S Q,SHAO X B,et al.Creating leptin-like biofunctions by active immunization against cLEPR in growing chickens[J].Domest Anim Endocrinol,2015,50:55-64.

[18]RAPOPORT B,CHAZENBALK G D,JAUME J C,et al.The thyrotropin(TSH)-releasing hormone receptor:interaction with TSH and autoantibodies[J].Endocr Rev,1998,19:673-716.

[19]MCLACHLAN S M,NAGAYAMA Y,RAPOPORTB.Insight into graves′hyperthyroidism from animal models[J].Endocr Rev, 2005,26:800-832.

[20]HILL R A,FLINT D J,PELL J M.Antibodies as molecular mimics of biomolecules:roles in understanding physiological functions and mechanisms[J].Adv Physiol Educ,2008,32:261-273.

[21]LEI M,WU S,LI X,et al.Leptin receptor signaling inhibits ovarian follicle development and egg laying inchicken hens[J]. Repro Biol and Endocri,2014,8:25.

(责任编辑:张震林)

Expression of recombinant protein of chicken leptin receptor extracellular domain mature peptide and the preparation of its polyclonal antibody

LEI Ming-ming1, WU Si-qian2, LI Xiao-wei2, SHI Zhen-dan1
(1.Laboratory of Animal Breed Improvement and Reproduction,Institute of Animal Science,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014, China;2.College of Animal Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

Two pairs of primers designed based on the chicken leptin receptor gene(LEPR)mature peptide sequence(GenBank:NM_AB033383)were used to amplify two cDNA sequence fragments of chicken LEPR extracellular domains(ECD)mature peptides with chicken liver cDNA as the template.The two cDNA sequence fragments were cloned into the BamH I and Hind III sites of the plasmid pRSET-A to generate the expression vector pR-LEPR1 and pR-LEPR2,which were further transformed into bacterium Escherichia coli BL21(DE3).The transformed bacteria were induced to produce recombinant proteins LEPR1 and LEPR2 with the expected molecular mass of 2.62×104and 2.86×104by IPTG.The recombinant LEPR1 and LEPR2werepurifiedandmixedintomineraloil adjuvant to immunize growing chickens to produce anti-LEPR1 and anti-LEPR2 antibodies.Antisera with high anti-LEPR1 and anti-LEPR2 titers were obtained after three immunizations.

leptin receptor;mature peptide;cloning and expression;polyclonal antibody

S831.2

A

1000-4440(2015)05-1105-05

雷明明,吴思谦,李孝伟,等.鸡瘦素受体胞外域成熟肽重组蛋白质的表达以及多克隆抗体的制备[J].江苏农业学报,2015,31 (5):1105-1109.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.05.025

2015-03-05

国家自然科学基金项目(31501946);江苏省自然科学基金项目(BK20150544)

雷明明(1977-),女,湖北赤壁人,博士,研究方向为动物遗传与繁殖内分泌。(Tel)025-84390772;(E-mail) mm0529@163.com

施振旦(1964-),(Tel)025-84390956;(E-mail)zdshi@ mail.jaas.ac.cn