逆流法建立大鼠子宫内膜异位症模型*

逆流法建立大鼠子宫内膜异位症模型*

王哲1路芳2#（1山东中医药大学附属医院 济南250011；2山东中医药大学 济南250014）

目的：通过与种植法建模对比，探讨逆流法建立大鼠子宫内膜异位症模型的可行性及建模成功率。方法：研究分逆流组、种植组、空白组，分别进行手术，术后8周观察组织形态变化并采静脉血检测EMAb、CA125，判定成模情况。结果：逆流组成模率为70%，种植组成模率90%。结论：逆流法建模成功，但成模率较种植法稍低。

子宫内膜异位症；动物模型；逆流法

子宫内膜异位症（EMT）的难治性及复杂性逐渐引起临床医师的关注，但由于人体研究的局限性，动物模型为内异症病理生理的研究、治疗方法的探索提供了一个很好的载体。研究发现，大鼠内异症模型与人类内异症在许多方面有相似和相近之处。我们用手术逆流的方法建立大鼠EMT模型，并对模型进行组织学观察及生化指标检测以评价造模成功与否，为临床发病机理及治疗方法的研究提供更好的支持。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物 健康性成熟6～9周龄雌性未交配wistar大鼠，体重160～190 g，由山东大学动物实验中心提供。许可证号：SCXK（鲁）20090001。

1.1.2 药物 水合氯醛；注射用青霉素钠（国药准字H37020079，批号：S130401）；戊酸雌二醇（国药准字J20080036，批号：202A2）。

1.2 方法

1.2.1 分组 逆流组（逆流建模）、种植组（种植建模）、空白组（正常对照组）各10只。

1.2.2 术前准备 术前1 d给予造模大鼠灌服戊酸雌二醇，剂量为0.5 mg/kg，使手术时大鼠统一处于发情期。

1.2.3 模型制作 逆流组：以10%水合氯醛（300mg/kg，腹腔注射）麻醉，然后将大鼠固定于手术板上，腹部剪毛，常规消毒，在尿道口上约1 cm处切长1.5～2.0 cm的纵形切口进腹。暴露双侧子宫、输卵管、卵巢，于子宫近输卵管l cm处行5 mm纵向切口，用特制毛刷搔刮子宫内膜8周，6-0肠线缝合切口，用眼科无齿平钳夹闭子宫下段，将2 ml生理盐水经子宫输卵管注入腹腔，使子宫内膜组织逆行入盆腔，逐层缝合皮肤和皮下组织。种植组：开腹方式同逆流组，开腹后，分离左侧子宫，结扎两端子宫及子宫系膜血管，切除长1.5～2.0 cm的子宫段，立即放入生理盐水中，修剪去子宫浆膜外的脂肪组织，纵向切开子宫腔，剥去浆膜层及肌层，切取5 mm×5 mm的片段，分别以6-0号丝线将内膜缝合于右侧子宫、右侧卵巢及输卵管周围的脂肪组织、腹壁血管丰富处、皮下，逐层缝合皮肤和皮下组织。两组大鼠术后自然苏醒，分笼单放，常规饲养。空白组：不手术，正常饲养。

1.2.4 术后用药 术后逆流组、种植组大鼠连续5 d灌服戊酸雌二醇0.1 mg/kg，腹腔注射青霉素16万U/kg。

1.3 观察指标

1.3.1 组织形态学观察 抽血后，处死大鼠，立即解剖，观察异位包块情况，取异位内膜包块、在位子宫即逆流组、种植组左侧子宫中段及对照的空白组大

鼠子宫的一段，甲醛固定，常规制片，HE染色，在光镜下观察在位、异位内膜及正常子宫内膜的组织形态学特点及差异。

1.3.2 生化指标 术后8周，抽取大鼠腹主动脉血2 ml，用ELISA法检测血清中EMAb（antiendometrial antibody，抗子宫内膜抗体），CA125（cancer antigen 125，癌抗原125）。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料用方差分析，结果以（x±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学观察 术后第8周，解剖后见异位内膜包块大小不等，最大的为10.00 mm×9.76 mm，最小的为2.30 mm×2.20 mm，包块为囊状，内有积液感，逆流组10只模中有3只未形成囊状，建模成功率为70%；种植组10只模中有1只未形成囊状，建模成功率为90%。种植组成模大鼠异位内膜出现于腹壁5只、卵巢及输卵管4只、皮下2只；逆流组异位内膜出现于腹壁4只、卵巢及输卵管3只、皮下1只。光镜下空白组大鼠子宫内膜上皮细胞排列完整，肌层较厚，结构完整，腺体和血管丰富。逆流组与种植组在位及异位内膜的上皮细胞扁平，呈长柱状或增生呈假复层结构，大部分有分泌现象，少数可见腺体分布，肌层较薄，结构不清。见图1～图3。

2.2 生化指标比较 各组之间CA125（F=113.407）、EMAb（F=96.449）均有明显差异（P＜0.05），且种植组、逆流组、空白组依次降低（P＜0.05）。见表1。

3 讨论

3.1 造模方式 手术移植法是目前国内外报道的建立EMT模型的主要方法。对模型动物的选择，多选用大鼠与兔，该实验选择大鼠，是因为大鼠的激素水平较高，性周期短且规律，对造模的成功及观察较为有利且较经济。该研究采用逆流法模拟人体的经血逆流原理造模，更贴近于临床发病实际，且手术操作简单。实验时手术应做到以下几点：（1）在手术前24 h给大鼠灌服戊酸雌二醇，人为的使大鼠在手术时统一在发情期。术中，剖开大鼠腹腔后可见大鼠的子宫均处于充盈状态，方便手术的进行。（2）逆流手术时，分离子宫，将子宫内膜搔刮，接着用生理盐水将其冲入盆腔，缩短了手术时间。子宫内膜异位症可出现在身体的不同部位，但绝大多数位于盆腔内的卵巢、宫底韧带、子宫下部后壁浆膜面及覆盖直肠子宫凹陷、乙状结肠的腹膜层[1]。本实验模拟人体的经血逆流将搔刮后的子宫内膜逆流冲入盆腔，可以观察子宫内膜异位症的多发部位。逆流组及种植组异位内膜均多出现于腹壁，其次为卵巢及输卵管，最后为皮下。手术中保持无菌，使进行造模的大鼠无1只发生术后感染；术后1周，切口已经完全愈合。3.2 观察指标

3.2.1 组织形态学观察 简单可行，同时测量异位灶的大小，将其量化，更能够准确判断其成模情况，逆流组与种植组均出现内异症病灶，逆流组较种植组组织大体观及镜下观均显示成模率低，但仍有70%建模成功。

3.2.2 生化指标 EMAb[2]是以子宫内膜为靶抗原，并引起一系列免疫病理效应的自身抗体。目前EMAb被认为是EMT标志性抗体，文献[3]报道EMT患者中EMAb的检出率可达70%～80%。CA125是肿瘤标记物的一种，是一种高分子量的糖蛋白抗原，主要来自分泌期子宫内膜，内膜细胞产生CA125的量代表细胞的增活性。有文献资料报道了血清CA125测定对内异症有较理想的诊断价值[4～6]。研究报道血清CA125与EMAb联合测定可在敏感性下降不多的情况下，明显提高特异性；同时如两者均阳性，EMT的诊断基本成立；两者均阴性诊断基本不成立[7]。因此通过联合检测血CA125、EMAb的变化可以较准确的反映子宫内膜异位症的成模情况。本研究中逆流组较种植组血清CA125与EMAb均低，但较空白组明显升高，证实逆流法建模成功。

3.3 原因分析 该研究中逆流法成模率较种植法稍低，考虑以下原因：（1）大鼠输卵管组织较细，子宫内膜组织不能够完全通过子宫输卵管进入盆腔；（2）大鼠免疫功能强大，到达盆腔的部分子宫内膜组织可被吞噬而不形成内异症；（3）搔刮过程中脱落的子宫内膜组织的数量致成模率低。

经血逆流法制造子宫内膜异位症模型较种植法成模率稍低，但经血逆流法操作更简单、手术时间短、创伤小、术后恢复快，避免了实验中手术因素导致的差异。该实验手术均是对宫腔操作，可以在不开腹的情况下完成，对以后实验应用于大型动物如猿猴等的研究提供了新的造模方法；同时对于其他学说所致子宫内膜异位症也可以提供借鉴。该过程更符合人体发病的自然过程，为以后临床中研究子宫内膜异位症的发病机理及治疗提供了新的方法，也拓宽了临床研究的思路。但该实验仅考虑经血逆流种植因素，其他方面的发病机制仍需进一步研究。

[1]乐杰.妇产科学[M].第7版.北京:人民卫生出版社,2010.325

[2]关坤萍,贾克丽,郭慧芳.细胞凋亡基因p53在子宫内膜异位症的表达[J].中国药物与临床,2008,8(10):794-795

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Establishing Ratendometriosis Model with Reflux Method

WANG Zhe1,LU Fang2(1Shandong University Hospital of Traditional Chinese Medicine,Jinan250011;
2Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan250014)

Objective:To discuss the feasibility and success rate of establishing the rat endometriosis model by comparing reflux method with planting method.Method:Lab rats were divided randomly into three groups:reflux group,planting group and control group. Each group were given surgery respectively and tissue morphological variations and EMAb and CA125 in venous blood were observed and tested 8 weeks afterward to compare the conditions of each group.Results:The success rate of reflux model was 70%,and the rate of planting model was 90%.Conclusion:Modeling with reflux method can achieve high success rate but the rate is lower than modeling with planting method.

Endometriosis;Animal models;Reflux method

R614.42

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2015.06.002

山东省中医药科学研究项目（编号：2010-093）#通讯作者：路芳，E-mail：zplufang@163.com