隐匿性乙型肝炎病毒感染研究进展*

陈建宏，刘妍，李进 综述，徐东平 审校

传统的观点认为血清HBsAg的转阴和抗-HBs的出现是HBV完全清除的标志。1978年，Hoofnagle et al[1]发现HB-sAg阴性，抗-HBc阳性的供血者可使受血者发生HBV感染，提出了隐匿性感染的存在，但由于当时病毒检测技术的限制，这种观点一直颇受争议。随着病毒检测技术的进步，特别是PCR（Polymerase Chain Reaction）技术的不断成熟，不少研究证实了OBI的存在。根据其血清学特征可将OBI分为血清学阳性和血清学阴性两类，血清学阳性的患者是指抗-HBc阳性伴或不伴抗-HBs阳性，血清学阴性患者所有的HBV血清标志物都是阴性。本文将从流行病学特点、发病机制、临床转归和诊断治疗等方面对OBI进行系统的阐述。

1 隐匿性HBV感染的流行病学特点

OBI的发生率与不同国家、不同地域的HBV的流行率相关，在发展中国家发生率高，在西方发达国家发生率低；在HBV高发区较常见，在HBV暴露率低的地区则很少发生。例如在在巴西亚马逊地区，3600名献血者中有8名为OBI[2]，而在荷兰，440万份献血标本中，只有23份可以检测到HBV DNA[3]。

OBI的流行率还与所选取的研究人群有关。慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染者中OBI的发生率比其他慢性肝脏疾病高。在非肠道给药的人群中，OBI的发生率较高，在血友病患者为7.8%[4]，在血液透析者为14.7%[5]。肝细胞癌（HCC）患者中OBI的发生率较高，特别是在不明原因的HCC患者中，其发生率高达73%[6]。研究样本的血清学表现也会影响OBI的发生率，在对北美因纽特人社区的研究中发现，HBsAg阴性者中有既往感染HBV血清学表现者和无既往感染血清学表现者OBI的发生率分别为18%和8.1%[7]。此外，样本量的大小和一些未知的混杂因素也会影响OBI的发生率。

Ireland et al[8]用7种不同的试剂盒检测13种突变株在体外表达的抗原，其结果不尽相同，这说明不同检测方法的灵敏性和特异性也会影响OBI的发生率。

2 隐匿性HBV感染的发生机制

OBI的发生机制尚未完全明确，可能有多种因素参与其中，下面我们将根据现有报导从HBV自身因素、宿主因素以及共同感染等方面对OBI的发生机制进行系统的阐述。

2.1 HBV低水平复制和表达研究发现，急性肝炎HBsAg转阴后10年以上，从患者的血清、肝组织或者外周血淋巴细胞中仍能检测到HBV DNA，但均处于较低的水平，并且体内一直存在较强的HBV特异性T细胞免疫反应[9]，提示即使HBsAg转阴多年后，HBV并不一定能被机体完全清除，而是在机体免疫系统的压力下处于一种极低的复制和表达水平，现有的常规检测技术无法检测到。长期抗病毒治疗导致的RT区耐药突变也可以导致HBV复制力降低，也可能导致OBI的发生。

2.2 HBV整合 HBV侵入人体后可以整合到宿主DNA上，特别是在肝癌患者，85%～90%的HCC患者的DNA中可以发现整合的HBV DNA，并且大多是以不完整的DNA片段的形式整合到宿主DNA的不同位置[10]，破坏了HBV和宿主基因组的完整性，导致HBsAg不表达或无法被识别，从而形成OBI状态，这也可能是HCC患者中OBI发生率较高的原因。

2.3 HBV S基因变异 S基因变异主要是通过影响HBsAg的表达、分泌和识别等机制导致OBI的发生。a决定簇（aa121-147）是HBsAg上相对保守的区域，是宿主免疫反应识别的主要位点，其间的一些点突变如C124Y，D144A等可以降低HBsAg的抗原性，导致表达的HBsAg无法被现有的试剂盒识别；亲水区的一些变异如I126S，Q129R，G145R等能损害病毒或表面抗原的分泌，使其无法从内质网上释放到血清中，形成OBI状态[11，12]；Pre-S区的缺失突变可以影响HBsAg的表达导致OBI的发生[13]；糖基化修饰可以保护抗原免受抗体的攻击，亲水区内的新发糖基化位点可以通过模拟B细胞表位的作用干扰HBsAg的识别，从而形成OBI状态[14]。

2.4 HBV潜伏于PBMCs急性或者慢性乙型肝炎HBsAg转阴后，仍可以从患者的PBMCs中发现HBV DNA，研究发现HBV相关疾病的患者在肝移植后接受大量的抗-HBS治疗，其血清中的HBsAg和肝组织中的HBV DNA都转阴，但是在其PBMCs中仍可检测到HBV DNA，这提示PBMCs可能是OBI患者HBV持续低水平复制的场所。Coffin et al[15]发现感染急性WHV的土拨鼠血清学转阴后仍可以从PBMCs中检测到WHV DNA，WHV和HBV的分子特性和病理学特性十分相似，因此从动物实验的角度很好的证明了上述观点。

2.5 宿主的免疫因素 研究发现一旦病毒被从宿主的肝组织微环境中分离出来，它的复制，转录和蛋白合成功能可以完全恢复，这有力的证明了宿主免疫系统对病毒活动的影响[16]。HBV感染的结局与病毒的复制力和机体的免疫状态之间的相互作用有关，当机体的免疫功能足够强时，可以将病毒完全清除，相反，如果病毒的复制力相对较强，免疫系统只能将其抑制在较低的复制水平，但无法将其完全清除，形成OBI状态[16]。OBI献血者血液中的HBV特异性T细胞应答，要比不活跃的携带者强很多[9]，这可能是因为被免疫系统抑制但又没有完全清除的HBV仍能合成微量的抗原，低于现有方法的检测下限，但是达到了刺激特异性T细胞反应的阈值。固有免疫因子如IFN和TNF-α在病毒的复制控制中也起到一定的作用[17]，特别是在那些获得性免疫功能较差的OBI患者。

2.6 宿主的表观遗传因素表观遗传因素主要是通过对HBV DNA的甲基化和cccDNA上组蛋白的乙酰化来发挥作用。HBV DNA表面抗原启动子区域的CPG岛的甲基化可以导致基因沉默[18]，从而使HBsAg不表达。Vivekanandan et al[19]的研究发现将重组的甲基化的HBV DNA体外转染肝癌细胞，HBsAg的表达降低90%。另有研究研究发现结合到细胞核内的cccDNA上的组蛋白H3、H4的乙酰化状态调控着HBV的复制，乙酰基转移酶的水平与病毒体外复制的水平平行，而组蛋白脱乙酰化酶的上调与体外病毒的低复制力和体内的低病毒血症有关[20]。机体通过上述两种表观遗传机制调控HBV的复制和表达，可能是OBI的形成机制之一。

2.7 共同感染除了HBV自身因素和宿主因素以外，共同感染的微生物也可以抑制HBV的活动，促进OBI状态的形成。这一现象在HCV患者最常见，Cacciola et al[21]对200例HBSAg阴性的HCV患者的血清或肝组织进行检测，66例可以检测到HBV DNA，而50例HBSAg和HCV标志物都阴性的患者中，只有6例可以检测到。HCV核心蛋白可能在这一过程中发挥直接的作用，它可以与反式激活因子HBx结合抑制HBV的表达，也可以与HBV聚合酶形成复合体，抑制其复制[22]，也有研究认为共同感染的HCV是通过调节固有免疫或适应性免疫间接的导致OBI的形成[23]。其它微生物如曼氏血吸虫对HBV也有较强的抑制作用[24]，共同感染时可使患者表现为OBI状态。

3 隐匿性HBV感染的临床意义

3.1 OBI的传播 OBI是乙型肝炎传播链上不可忽视的传染源，患者可以通过输血、肝移植或者分娩的方式进行传播，使受者感染HBV。在输血或肝移植引起的HBV患者体内可以发现与捐献者相同的HBV基因组[25，26]。在西方等发达国家，由于HBV的流行率低，并且大多采用联合HBsAg与抗-HBc或HBV核酸检测的方法来筛查献血者，输血后肝炎发生率已经非常低，但在某些发展中国家，由于HBV的高度流行，并且仍采用检测HBsAg的方法来筛查献血者，输血后肝炎的发生率相对较高。并不是所有的受血者都会发生HBV感染，宿主的免疫功能、输血量和OBI患者的病毒载量会影响其发生率。在美国，为了预防肝移植引起的传播，抗-HBc阳性的捐献者的器官只被用于十分紧急的情况，但是在HBV高发的地区，由于器官的短缺，这种做法是不切实际的。OBI患者还可以通过垂直传播的方式使子代感染HBV，Pande et al[27]对222名接种过重组乙肝疫苗的新生儿（其母亲均为HBsAg阳性）进行18周的随访，发现6/222（3%）发展成显性HBV感染，142/222（64%）发展成OBI，提示乙肝疫苗接种可以预防显性HBV感染的垂直传播，但可能无法阻断OBI的传播。

3.2 OBI的复燃宿主的免疫系统功能在OBI的发生过程中起到关键的作用，免疫功能正常时可以将HBV抑制在一种极低的复制和表达水平，当OBI患者在免疫功能低下或者接受免疫抑制治疗时，免疫系统无法抑制相对复制力较强的病毒株，HBV DNA可以复燃，恢复正常的复制和表达，重现经典的血清学表现[28]。预防性的抗HBV核苷酸类似物治疗可以预防正在接受免疫抑制治疗的HBsAg阳性的乙肝患者的DNA活化，但能否在OBI患者身上应用防止其复燃还是个有争议的问题。

3.3 OBI与肝脏疾病的进展 OBI能加速肝脏疾病的进展，特别是在HCV患者，Squadrito et al[29]对伴有OBI的HCV患者和HCV单独感染者进行11年的随访调查发现肝硬化的发生率分别为33.3%和13.5%。虽然OBI患者引起的炎症反应很轻，但是长期持续的炎症反应引起肝的坏死性炎症，促进慢性肝炎向肝硬化进展，最终发展为HCC[30]。还有研究表明OBI可以降低HCV患者对干扰素的反应，从而使HCV患者的病情进展加快[31]。针对HBV的免疫反应如细胞毒T淋巴细胞介导的免疫反应也可以加快肝脏疾病的进展。HBsAg分泌障碍，大量堆积在内质网中导致内质网压力升高，造成肝细胞的持续损伤，也可能是OBI加快肝脏疾病的进展的原因之一。

3.4 OBI与HCC许多研究发现OBI与HCC的发生有很强的相关性，到底OBI只是HCC发生的辅助因素还是独立的危险因素呢？来自日本的两个研究给出了我们答案，一个研究对82名HBsAg和HCV阴性的肝硬化患者进行随访，经过5年的随访HBV DNA阳性和阴性患者的肿瘤发生率分别为27%和11.8%，经过10年的随访，HBV阳性组全部发生肝癌，HBV阴性组肿瘤的发生率为27%[30]；另一个研究发现用干扰素将HCV感染消除后，OBI仍能导致肝癌的发生[32]。这很好的证明了OBI是HCC发生的独立危险因素。

HBV被认为通过直接或者间接的机制发挥着它的前致癌基因的作用。OBI患者长期持续的HBV感染引起的坏死性炎症，促进慢性肝炎向肝硬化进展，间接的加快了HCC的发生；OBI患者的HBV能整合到宿主的基因组中，使宿主基因组或者HBV自身发生改变，有着直接的致瘤作用。HBV的整合是随机的，它可以破坏宿主基因组维持染色体稳定的调控机制导致宿主基因组的高度不稳定，引起宿主基因功能的改变，引起原癌基因的表达上调或者抑癌基因的表达下调，例如：P53，Rb，cyclins和 Ras，最终导致肿瘤的发生[33]，也可以导致自身的功能发生变化，主要是导致HBx或者Pre-S/s的改变，产生截断或者变异的蛋白，这些蛋白可能会扰乱宿主基因的表达调控机制或者激活致癌信号通路，从而导致肿瘤的发生[34]。这种基因的重排导致的病毒或者宿主基因的变异导致了肿瘤的发生。OBI患者的一些基因突变也有直接的致癌作用，研究发现OBI患者基因组的Pre-S2（M1I和Q2K）和增强子Ⅱ的G1721A在伴有OBI的肿瘤患者的发生率比其他HCC患者高[35]。

4 隐匿性HBV感染的诊断和临床应对措施

OBI患者是潜在的传染源，早期诊断可以减少其传播并且可以及时采用相应的治疗措施，控制和延缓病情的进展。

研发高灵敏度和特异度的HBsAg检测试剂盒，使用巢式PCR和实时PCR等高敏感性和特异性的方法对核酸进行检测，对降低OBI的误诊和漏诊有很大的作用。用新鲜的肝组织进行检测也会提高HBV DNA的检出率，在取不到肝组织的情况下，可以增加提取DNA的血清量，至少从1ml的血清中提取，并且连续多次检测纵向血清，可以增加HBV DNA的检出率[26]。在有不明原因肝损害的患者，抗-HBc的存在有一定的诊断意义[15]，为了减少传播的可能性，尽量不用该类患者的血液，组织或者器官进行移植，对这类患者进行免疫抑制治疗时也要十分谨慎。关于OBI患者是否要采用预防性的抗病毒治疗目前仍存在很大的争议，持续低水平的HBV DNA会加快肝脏疾病的进展，但是长期的抗病毒药物治疗也势必会对肝功能造成一定的损害，二者的利弊需要大量的临床实践和回顾研究来衡量。免疫系统与HBV相互作用是OBI形成的主要原因，免疫力的消弱可诱发肝炎的复燃，因此在对抗-HBc阳性的HBV既往感染者应用免疫抑制剂时应考虑使用抗HBV药物预防肝炎复燃，而研发和应用增强抗HBV免疫应答力的药物是清除HBV感染的另一个重要途径。

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