反射式共聚焦显微镜在皮肤恶性黑素瘤中的应用进展

吴冬梅，李 青，戴耕武

皮肤恶性黑素瘤是一种起源于黑素细胞的恶性肿瘤，占全部恶性肿瘤的3%，发病率占皮肤恶性肿瘤的第3 位[1]。研究显示，恶性黑素瘤的发病率呈明显上升趋势。早期、准确诊断可明显提高皮肤恶性肿瘤5 年存活率[2]。肿瘤的预后和浸润深度密切相关，因此早期诊断恶性黑素瘤一直是研究热点。然而恶性黑素瘤的早期诊断一直是临床上的一个难题。以往初筛主要依靠临床医生的视诊ABCDE 法，但是误诊、漏诊率极高。尽管组织病理学和免疫组化仍是恶性黑素瘤最终确诊的金标准，但是部分患者在组织病理和免疫组化检查后诊断仍存在争议[3]。反射式共聚焦显微镜（refl ectance confocal microscopy，RCM）可检测至细胞水平，弥补了皮肤镜探测层次浅，无法显像皮肤组织结构；皮肤超声可对皮肤深部结构显像，但是具有分辨率低的缺陷。RCM 可探测深度达到200 μm，即真皮乳头浅层，因而RCM 又被称为“光学活检仪”[4]。由于黑素是共聚焦成像中主要对比成分，能强烈折射红外光，有最高的折射率和亮度，这就使共聚焦显微镜在色素性皮肤病，尤其是黑素性疾病的临床应用中具有很多的优势[5]。同时RCM 也作为组织病理和免疫组化诊断恶性黑素瘤之外重要的辅助检查手段。

1 RCM成像的原理及发展

Marvin Minsky 于1957 年发明了激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM），由最初的单一CLSM 发展到现在的双光子共聚焦显微镜、多光子共聚焦显微镜、活细胞共聚焦显微镜等多种细胞测量工具[6]。目前CLSM 主要分为2 种模式，一种为反射式，主要用于临床实践；一种为荧光扫描共聚焦显微镜，主要用于科学研究。反射式全称为RCM，其成像是基于皮肤的细胞器和其他组织结构自身的折射率不同[7]。黑素细胞的细胞器具有高折射率，可使更多的光折射回RCM。因此，在黑素细胞聚集的部位则成像为明亮区。通过细胞异形性、色素分布的均匀度、角质形成细胞界限消失、皮损部位的血流速度可有助于区别皮损的良恶性。RCM 成像需要一系列组件，包括光源、集光器、物镜片、光敏探测器[8]。RCM 将低功率激光束聚集于皮肤一点，透过皮肤结构后进行折射，然后通过探测光路系统的针孔传输至探测器。针孔处的过滤器只接收从焦点处反射的光，焦点以外的反射光则被针孔滤过。折射光转化为电信号，并在断层扫描仪处形成三维图像[9]。因成像深度取决于RCM 使用的光波长，为达到最大成像深度，RCM 使用830 nm 近红外光，可对皮肤结构250 ～300 mm 处成像，对应解剖层次为真皮浅层。RCM 最大放大倍数40 ～100 倍, 横向分辨率为0.5 μm, 最小光学切片厚度1.7 μm[10]。RCM 诊断的敏感性和特异性依赖于操作者的经验和水平，但是目前有学者研究使RCM 成像的分析完全自动化，在将来可极大地提高诊断准确率，降低操作者对诊断敏感性和特异性的影响[11]。

2 RCM在皮肤恶性黑素瘤中的应用

2.1 RCM在皮肤恶性黑素瘤的诊断标准

文献表明恶性黑素瘤的RCM 诊断包括2 个主要指标（无边缘的真皮乳头和非典型性的真表皮交界细胞）和4 个次要指标（圆Paget 样细胞,表皮有广泛的Paget 样细胞浸润，真皮乳头层可见有核细胞和真皮中有脑回状细胞簇）[2]。与皮肤镜诊断恶性黑素瘤的两步法程序相似，有学者提出使用RCM 两步法准则诊断皮肤恶性黑素瘤。首先根据系统成像的4个特征区别黑素细胞及非黑素细胞性皮损，圆形鹅卵石样细胞，表皮有广泛的Paget 样细胞浸润，真表皮交界处呈筛网状和真皮中有细胞巢。然后再根据恶性黑素瘤的诊断标准进一步进行诊断[12]。值得注意的是RCM 成像很难区别表皮朗格汉斯细胞与黑素细胞，而二者均可在RCM成像中表现为黑素细胞Paget样分布。

一项回顾性研究分析了24 例黑素细胞痣患者，因具有明亮的Paget 样细胞而被RCM 误诊为恶性黑素瘤。这些患者中23 例高密度分布的朗格汉斯细胞表现为明亮的Paget 样细胞，7 例黑素细胞表现为明亮的Paget 样细胞。6 例明确诊断为恶性黑素瘤患者中， 5 例有高密度分布的朗格汉斯细胞表现为明亮的Paget 样细胞，6 例患者均具有Paget 样黑素细胞[13]。表明尽管明亮的Paget 样细胞有助于诊断恶性黑素瘤，但是朗格汉斯细胞及Paget 样黑素细胞均可表现为明亮的Paget 样细胞，这就增加了诊断的难度。Guitera 等[14]发现RCM 可用于鉴别皮肤恶性黑素瘤亚型，尤其是恶性雀斑样痣及无黑素性恶性黑素瘤。这些亚型很难通过临床观察或皮肤镜诊断发现。近期Losi 等[15]分析了20 例无黑素性恶性黑素瘤RCM图像，发现角质形成细胞中布满反射减弱的Paget 样细胞，认为其是诊断无黑素性恶性黑素瘤的新标准。尽管异形角质形成细胞是诊断标准之一，但是有必要增加诊断标准，使诊断更加准确。值得注意的是，Gabriel 等[16]研究发现，在极少见的恶性黑素瘤与基底细胞癌并发的患者，使用皮肤镜无法明确诊断。皮损肉眼观察高度怀疑为恶性黑素瘤，但不确定是否并发其他皮肤癌。使用RCM 可发现在表皮层明亮的圆形细胞在棘层排列紊乱，乳头缘消失，细胞成团分布。这些均为并发皮肤肿瘤诊断提供有价值信息。最终结果与免疫组化、组织病理检查结果一致。

2.2 RCM与皮肤镜诊断恶性黑素瘤的特异性和敏感性

目前临床上将RCM 成像诊断的敏感性和特异性与皮肤镜的比较较多，RCM 和皮肤镜的主要缺点是诊断准确率均需依赖仪器使用者的经验和水平。在美国，仅有60%的皮肤镜使用者经过培训，其中不足50%在日常医疗诊断工作中会使用皮肤镜[17]。而即使是经验丰富的皮肤镜专家，诊断皮肤恶性黑素瘤，尤其是直径＜6 mm 的皮损也是非常有挑战性的工作。通过皮肤活检证实其敏感性为71%[18]。Langley等[19]将RCM 与皮肤镜诊断黑素瘤的敏感性及特异性进行比较，结果显示，RCM 敏感性为97.3%，特异性为83%；皮肤镜敏感性为89.2%，特异性为84.1%。二者相比特异性差异不大，RCM 诊断恶性黑素瘤的敏感性明显较皮肤镜高。

Gerger 等[20]的一项回顾性研究显示，将来自50 例黑素细胞痣及20 例黑素瘤患者皮损的3 709 张RCM 成像图片进行分析，结果显示敏感性为97.5%，特异性为99%。但是Dimitrow 等[21]研究却发现，RCM 诊断黑素瘤的敏感性为71%～95%，特异性为69%～97%。认为RCM 在诊断良、恶性黑素瘤的敏感性和特异性较高，高于临床医生经验性诊断，与皮肤镜相比却无太大差异。

2.3 RCM在恶性黑素瘤诊断和治疗中的应用

有统计显示，在美国，皮肤恶性黑素瘤治疗不当受到索赔的原因中未完全切除皮损、结节性黑素瘤的误诊、将恶性黑素瘤误诊为发育不良痣占首要因素[22]。因此这也提示以明确诊断为目的的皮肤肿物切除，在条件允许的情况下，应当整体切除皮损，避免部分切除。介于良、恶性皮肤黑素瘤的皮损，对于临床专家来说，肉眼辨别也是有难度的。先于皮肤活检前使用RCM 可避免某些患者不必要的活检，但是Eichert 等[23]认为是否需要行手术活检，某种程度还依赖RCM 使用者的经验。Longo 等[24]研究认为，皮损面积大，生长部位特殊（如面部、头皮、足跖），若完全切除并行活检，则手术过程复杂，涉及术后损容；若部分切除，则易致良性皮损的过度治疗，甚至可在术后瘢痕处出现黑素再生或面积扩大。

RCM 可区分术后瘢痕处黑素细胞的良、恶性。瘢痕处复发的恶性黑素瘤RMC 成像显示，大片树突状黑素细胞、Paget 样细胞及树突细胞布满瘢痕处表皮，有明显的异形细胞。Nouran 等[25]分析了5 例术后复发的恶性雀斑样痣患者，皮肤镜成像显示复发皮损失去了原发皮损的显著特征，呈现非特异性成像，原因为瘢痕形成造成了明确诊断的困扰。而RCM 成像则不受其困扰，诊断原发皮损的标准仍然适用于复发皮损。面部的恶性雀斑样痣在临床及形态学特征上与日光性角化、日光性雀斑样痣很难鉴别。Alarcón等[26]采用RCM 诊断3 例面部恶性雀斑样痣患者，并为切除皮损准确界定范围。

RCM 在外阴着色性疾病的诊断研究较少，成像诊断标准尚未确立。临床上女性外阴黑素瘤与女性外阴黑变病较难鉴别。Cinotti 等[27]采用RCM 分析了8 例女性外阴黑变病患者的组织改变，结果其成像特征为乳头缘分布的明亮的单形细胞及上皮组织基底层出现明亮的树突状细胞；2 例女性外阴黑素瘤的成像特征为上皮组织分布异形细胞及真皮乳头缘细胞分布结构紊乱。这10 例患者RCM 结果均与临床及组织病理结果进行了比对。

如何准确定位皮肤恶性黑素瘤手术切除范围一直是研究热点，尤其是面部恶性雀斑样痣的切除更是涉及美容修复问题。值得一提的是Gaudy 等[28]提出“通心粉法”手术切除恶性黑素瘤皮损来替代Mohs法，具体方法为：第一步，在临床皮肤恶性黑素瘤治疗指南要求切除皮损范围处画一窄带，切除后迅速缝合，暂保留中央皮损，切除组织（形似通心粉）送冰冻切片，明确切缘有无肿瘤细胞浸润。若未完全清除肿瘤细胞，则重复上述步骤，直至肿瘤组织完全切除。第二步，切除中央皮损，同时进行缺损皮肤组织处的修复、重建。此法的优点在于术中无开放性伤口，无需对手术医师进行专业的Mohs 法培训。而Champin等[29]将RCM 与“通心粉法”相结合治疗33 例面部雀斑样痣患者，其中28 例患者在第一次切除即完全清除肿瘤细胞，平均切除宽度为2.7 mm，随访27 例患者，平均10 个月后无复发。二者的结合更大程度地保留了正常组织，减少切除次数，相比RCM 与Mohs 的联合操作更加简便。

3 小结

RCM 无创、在体、实时、高分辨率等特点使其在皮肤恶性黑素瘤的诊断和治疗中日渐发挥作用，提高了皮肤恶性黑素瘤的早期诊断率，降低了恶性黑素瘤患者的病死率和治疗费用。但是RCM 也有许多不足之处, 如仪器设备昂贵，许多中小医院无法承担购买费用；诊断的准确率依赖使用者的经验、水平，造成诊断结果的偏差。但是，目前有学者正着力于研究能够系统自动化分析、诊断皮肤肿瘤的仪器，并使仪器简单、小巧化，促进人机良好互动。可以预见RCM 将在皮肤肿瘤领域成为一种重要的辅助诊断和治疗的工具。

[1] Rigel DS, Russak J, Friedman R.The Revolution of Melanoma Diagnosis:25 Years Beyond the ABCDs [J]. CA Cancer J Clin, 2010, 60(5):301-116.

[2] Siegel R, Ward E, Brawley O, et al. Cancer statistics,2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths [J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(4):212-236.

[3] Marghoob AA, Scope A. The complexity of diagnosing melanoma [J]. J Invest Dermatol, 2009, 129(1):11-13.

[4] Diaconeasa A, Boda D, Neagu M, et al. The role of confocal microscopy in the dermato-oncology practice [J]. J Med Life, 2011, 4(1):63-74.

[5] González S, Gilaberte-Calzada Y. In vivo refl ectance mode confocal microscopy in clinical dermatology and cosmetology[J]. Int J Cosmet Sci, 2008, 30(1):1-17.

[6] Wokosin DL, Loughrey CM, Smith GL. Characterization of fura dyes with two-photon excitation [J]. Biophys J, 2004, 86(3):1726-1738.

[7] Meyer LE, Otberg N, Sterry W, et al. In vivo confocal scanning laser microscopy: comparison of the refl ectance and fl uorescence mode by imaging human skin [J]. J Biomed Opt, 2006, 11(4):044012.

[8] Gareau DS, Patel YG, Rajadhyaksha M. Basic Principles of Refl ectance Confocal Microscopy [M]//Gonzalez S, Gill M, Halpern AC. Reflectance Confocal Microscopy of Cutaneous Tumors. London: Informa Healthcare, 2008:1-3.

[9] Ono I, Sakemoto A, Ogino JK, et al. The real-time, three-dimensional analyses of benign and malignant skin tumors by confocal laser scanning microscopy [J]. J Dermatol Sci, 2006,43(2):135-141.

[10] González S, Gilaberte-Calzada Y. In vivo refl ectance-mode confocal microscopy in clinical dermatology and cosm etology [J]. Int J Cosmet Sci, 2008, 30(1):1-17.

[11] Wiltgen M, Bloice M, Koller S, et al. Computer-aided diagnosis of melanocytic skin tumors by use of confocal laser scanning microscopy images [J]. Anal Quant Cytol Histol, 2011, 33(2):85-100.

[12] Segura S, Puig S, Carrera C, et al. Development of a two-step method for the diagnosis of melanoma by refl ectance confocal microscopy [J]. J Am Acad Dermatol, 2009, 61(2):216-229.

[13] Hashemi P, Pulitzer MP, Scope A, et al. Langerhans cells and melanocytes share similar morphologic features under in vivo refl ectance confocal microscopy: a challenge for melanoma diagnosis [J]. J Am Acad Dermatol, 2012, 66(3):452-462.

[14] Guitera P, Pellacani G, Crotty KA, et al. The impact of in vivo reflectance confocal microscopy on the diagnostic accuracy of lentigo maligna and equivocal pigmented and nonpigmented macules of the face [J]. J Invest Dermatol, 2010, 130(8):2080-2091.

[15] Losi A, Longo C, Cesinaro AM, et al. Hyporefl ective pagetoid cells: A new clue foramelanotic melanoma diagnosis by reflectance confocal microscopy [J]. Br J Dermatol, 2014, 171(1):48-54.

[16] Salerni G, Lovatto L, Carrera C, et al. Correlation among dermoscopy, confocal refl ectance microscopy, and histologic features of melanoma and basal cell carcinoma collision tumor [J]. Dermatol Surg, 2011, 37(2):275-279.

[17] Noor O 2nd, Nanda A, Rao BK. A dermoscopy survey to assess who is using it and why it is or is not being used [J]. Int J Dermatol, 2009, 48(9):951-952.

[18] Friedman RJ, Gutkowicz-Krusin D, Farber MJ, et al. The diagnostic performance of expert dermoscopists vs a computer-vision system on small-diameter melanomas [J]. Arch Dermatol, 2008, 144(4):476-482.

[19] Langley RG, Walsh N, Sutherland AE, et al. The diagnostic accuracy of in vivo confocal scanning laser microscopy compared to dermoscopy of benignand malignant melanocytic lesions: a prospective study [J]. Dermatology, 2007, 215(4):365-372.

[20] Gerger A, Hofmann-Wellenhof R, Langsenlehner U, et al. In vivo confocal laser scanning microscopyof melanocytic skin tumours: diagnostic applicability using unselected tumour images [J]. Br J Dermatol, 2008, 158(2):329-333.

[21] Dimitrow E, Ziemer M, Koehler MJ, et al. Sensitivity and specifi city of multiphoton laser tomography for in vivo and ex vivo diagnosis of malignant melanoma [J]. J Invest Dermatol, 2009, 129(7):1752-1758.

[22] Ng JC, Swain S, Dowling JP, et al. The impact of partial biopsy on histopathologic diagnosis of cutaneous melanoma: experience of an Australian tertiary referral service [J]. Arch Dermatol, 2010, 146(3):234-239.

[23] Eichert S, Möhrle M, Breuninger H, et al. Diagnosis of cutaneous tumors with in vivo confocal laser scanning microscopy [J]. J Dtsch Dermatol Ges, 2010, 8(6):400-410.

[24] Longo C, Moscarella E, Pepe P, et al. Confocal microscopy of recurrent naevi and recurrent melanomas: a retrospective morphological study [J]. Br J Dermatol, 2011, 165(1):61-68.

[25] Erfan N, Kang HY, Cardot-Leccia N, et al. Reflectance confocal microscopy for recurrent lentigo maligna [J]. Dermatol Surg, 2011, 37(10):1519-1524.

[26] Alarcón I, Carrera C, Puig S, et al. Clinical usefulness of refl ectance confocal microscopy in the management of facial lentigo maligna melanoma [J]. Actas Dermosifi liogr, 2014, 105(3):e13-17.

[27] Cinotti E, Perrot JL, Labeille B, et al. Refl ectance confocal microscopy for the diagnosis of vulvar melanoma and melanosis: preliminary results [J]. Dermatol Surg, 2012, 38(12):1962-1967.

[28] Gaudy-Marqueste C, Perchenet AS, Taséi AM, et al. The "spaghetti technique": an alternative to Mohs surgery or staged surgery for problematic lentiginous melanoma (lentigo maligna and acral lentiginous melanoma) [J]. J Am Acad Dermatol, 2011, 64(1):113-118.

[29] Champin J, Perrot JL, Cinotti E, et al. In vivo refl ectance confocal microscopy to optimize the spaghetti technique for defi ning surgical margins of lentigo maligna [J]. Dermatol Surg, 2014, 40(3):247-256.