侵袭性毛孢子菌病的实验室早期诊断进展

田艳丽，廖 勇，吕雪莲，杨蓉娅

侵袭性毛孢子菌病是由毛孢子菌属所致的系统性感染，近年来报道的病例数逐年增多，多见于血液系统疾病、恶性肿瘤及其他免疫缺陷的患者，尽管给予抗真菌治疗，病死率仍较高（50%～80%）[1]。实验室诊断是毛孢子菌防治的重要依据，特别是早期实验室诊断对于改善该病的预后至关重要。现有检测毛孢子菌的方法可分为培养法和非培养法。培养法是检测真菌感染的金标准，但其培养时间长，对检测人员专业技能要求较高，特异性和敏感性低，且不能区分非致病性定植与侵袭性感染。与培养法相比， 非培养方法具有检测时间短、敏感性和特异性相对较高的特点。本文就侵袭性毛孢子菌病非培养检测方法的研究进展作一阐述。

1 血清学方法

血清学方法是通过检测病原真菌特异性的抗原、抗体及代谢产物等诊断侵袭性真菌感染的方法，为诊断及评价疾病的状态和预后提供线索和依据。

1.1 (1, 3)-β-D葡聚糖抗原[ (1,3)-β-D-glucan, BG]的检测（G试验）

BG 是广泛存在于各类真菌细胞壁上的抗原成分，除接合菌(毛霉菌和根霉菌)外，所有病原真菌的细胞壁上均含有BG。G 试验被广泛地用于侵袭性真菌感染的检测，包括念珠菌病和曲霉病[2]的早期诊断。当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理，BG 可从胞壁中释放出来，从而使血液及其他体液（如尿液、脑脊液，腹水，胸水等）中出现BG，且随感染的加重，其含量增高。

Yamamoto 等[3]最早报道了阿萨希毛孢子菌感染小鼠模型中BG 血清水平与抗真菌制剂使用存在量效关系，并推断BG 抗原检测可以用于侵袭性毛孢子菌病诊断和治疗有效性的监测。祝贺等[4]检测了侵袭性毛孢子菌动物模型中血浆、支气管肺泡灌洗液、尿液标本的BG 水平，G 试验的平均敏感性分别为76.67%、80.00%、10.00%，其中血浆、支气管肺泡灌洗液标本的检测结果与对照组相比差异具有统计学意义，而尿液标本的检测结果无统计学意义。然而，目前还没有文献报道G 试验在侵袭性毛孢子菌病的诊断敏感性和特异性的研究结果。Suzuki 等[5]分析33 例侵袭性毛孢子菌病患者的流行病学和临床特征，发现一组患者的G 试验只有50%呈阳性，而血培养阳性的患者中仅有少数G 试验阳性。Nakase 等[6]报道28 例侵袭性毛孢子菌病的血液病患者，仅有50%患者的G 试验呈阳性，然而G 试验阴性患者的总生存期与早期感染病死率均显著高于G 试验阳性患者。

有报道，G 试验不能用于隐球菌感染的诊断，一方面可能因为隐球菌在免疫缺陷患者体内生长缓慢，并形成厚荚膜。另一方面可能与新生隐球菌产生的BG 量比念珠菌和曲霉少相关。和新生隐球菌相似，阿萨希毛孢子菌细胞壁BG 含量较少，G 试验是否可以用于毛孢子菌感染的检测还有待进一步深入研究。

1.2 葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(glucuronoxylomannan，GXM )检测（乳胶凝集试验）

GXM 在新生隐球菌荚膜中含量最高，占荚膜成分的90%以上[7]，具有抗原性。利用乳胶凝集试验检测GXM 是目前临床上诊断隐球菌感染的最重要方法之一。GXM 也存在于毛孢子菌中,是阿萨希毛孢子菌细胞壁的重要组成成分[8]，尚未在其他病原真菌中发现。

Campbell 等[9]最早报道毛孢子菌感染的病死患者出现乳胶凝集试验的阳性结果。Lyman 等[10]在白吉利毛孢子菌临床分离株和环境分离株中均检测到GXM 抗原，且有研究表明，阿萨希毛孢子菌临床分离株比环境株释放更多的GXM 抗原[11]。Fonseca 等[12]研究了阿萨希毛孢子菌细胞壁GXM 的功能和结构特点，发现在细胞壁锚定、抗原性和抗吞噬能力上，与隐球菌荚膜GXM 具有相似性。然而，与新生隐球菌不同的是，37 ℃时，阿萨希毛孢子菌细胞壁和胞外分泌的GXM 表达下调。由于人类正常体温在 37℃左右，所以阿萨希毛孢子菌与新生隐球菌相比，其在感染宿主体内的GXM 抗原表达水平较低。有研究者认为GXM 或GXM 结合BG 抗原检测比单用BG 抗原检测更适合用于侵袭性毛孢子菌病的早期诊断与治疗预后的判断，但需要临床与实验室检测的进一步研究与证实[13]。

1.3 其他抗体

Davies 和Thornton[14]利用杂交瘤技术制备出2个鼠单抗MAbs：CA7 和TH1。通过免疫荧光和蛋白质印迹法研究表明， CA7 是一种免疫球蛋白G1（IgG1），主要结合于阿萨希毛孢子菌和星形毛孢子菌菌丝表面的一个60 kDa 的糖蛋白抗原。而TH1 是一种免疫球蛋白M（IgM），结合于分生孢子表面的特异性抗原。这两种单抗可特异性的识别和鉴定出阿萨希毛孢子菌和星形毛孢子菌，而不与毛孢子菌属中的其他菌种结合，同样也不识别其他常见的临床致病真菌，包括念珠菌属、隐球菌属、曲霉属、镰刀霉、足放线病菌属和毛霉菌属。

2 聚合酶链反应(PCR)技术在播散性毛孢子菌病的应用

2.1 PCR及相关技术

PCR 是通过扩增毛孢子菌特异基因片断而获得的快速、灵敏和特异的诊断方法。毛孢子菌的核糖体RNA 基因总长度约为7 850 bp[1,15]，其中，结构基因（SSU，5.8/5s，LSU）是高度保守基因序列，可以作为真菌属水平的分类及通用引物的设计。LSU 中的D1/D2 可变性较大，部分可以作为真菌种水平的鉴定，而作为种水平的鉴定的特异性的基因片段是内转录间隔ITS 区，基因间隔区IGS 区用于种内分型及菌株鉴定[15]。由于毛孢子菌种属的基因差异决定了对不同抗真菌药物敏感性有所不同，正确鉴定毛孢子菌种属对治疗药物的选择、提高临床疗效和降低病死率至关重要。

Hosoki 等[16]检测1 例组织细胞吞噬性脂膜炎脐带血移植治疗后患者，在使用抗真菌预防性治疗的同时，应用巢式PCR 早于血清学培养和临床菌血症症状出现前1 周检测出患者继发毛孢子菌感染。随后的中心静脉导管培养证实感染阿萨希毛孢子菌，该例患者的血清PCR 检测反应阳性持续到第39 天，直至该例患者进行抗真菌治疗成功后巢式PCR 检测才转为阴性。而在此期间BG 血清滴度一直保持正常水平。Nakajima 等[17]提取肺癌患者的肺活检标本的总DNA,扩增真菌ITS 区域进行测序，并成功鉴定出感染的病原体是阿萨希毛孢子菌。 Nagano 等[18]对77例肺囊性纤维化患者应用常规培养与PCR 技术检测真菌，收集痰样本提取DNA，扩增ITS 区域进行测序分析。77 个样本通过PCR 技术鉴定出2 例毛孢子菌属感染，培养的方法仅发现1 例阳性。

与血清学检测相比，PCR 技术具有更高的敏感性。Nagai 等[19]对11 例组织病理明确诊断的播散性毛孢子菌病患者的血清样本进行巢式PCR 检测，引物针对28S rDNA 序列设计。在11 例患者样本中，PCR 检测7 例阳性，GXM 检测6 例阳性。Sugita 等[20]分别通过PCR 法和乳胶凝集试验检测11 份血清，这些血清来自7 例尸检证实的侵袭性毛孢子菌病患者，针对阿萨希毛孢子菌的ITS 区设计菌种特异性引物；11份血清中，9 份巢式PCR 检测阳性，7 份乳胶凝集试验阳性。Mekha 等[21]对侵袭性毛孢子菌病患者的21份血清进行实时定量荧光PCR，引物基于rDNA 的IGS1 区设计，实时定量荧光PCR 检测样本均为阳性，而乳胶凝集试验检测阳性的只有16 份。

2.2 芯片技术

基因芯片是研究生物大分子功能的新技术,具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点。利用该技术结合多重PCR 针对ITS1、18S、5.8S 序列的微阵列杂交检测91 个样品，鉴定出14 种病原真菌，其中包括阿萨希毛孢子菌[22]。Hsiue 等[23]设计针对ITS1 或ITS2 区域寡核苷酸微阵列芯片用于分析116 例患者血培养真菌阳性的标本。该系统识别并鉴定16 个酵母菌属的77 个菌种，并能够检测和鉴定出2 个样本中的阿萨希毛孢子菌阳性，而表型的方法仅有1 个样本阳性。

Landlinger 等[24]应用Luminex xMAP 技术检测患者的外周血、血液培养样本、肺部浸润活检组织、支气管肺泡灌洗液和支气管气管分泌物，针对真菌基因组中高度可变ITS2 区域设计探针，检测并鉴定出3 种临床致病的毛孢子菌：阿萨希毛孢子菌、因肯毛孢子菌和皮样毛孢子菌。同时，从石蜡包埋的组织中检测鉴定到皮样毛孢子菌感染。

用探针设计除了可以识别ITS 区和间隔区1（IGS1），还 可 以 包 括28S rDNA 序 列 的D1/D2 区域。Diaz 和Fell[25]使用Luminex100 流式荧光杂交试验，鉴定39 株不同的毛孢子菌，且证实利用ITS 和D1/D2 区域区分种属是灵敏的，IGS 的区域可用于区别种属关系密切的菌种，如阿萨希毛孢子菌、日本毛孢子菌和星形毛孢子菌。

2.3 PCR衍生技术的应用

聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCRRFLP）法是利用PCR 扩增相应目的片断，而后进行限制性内切酶切反应，电泳后观察比较限制性图谱来分析序列之间的差异。Fadda 等[26]通过研究发现，扩增18S-ITS1-5.8S (r)DNA，并应用HaeIII 内切酶消化进行PCR-RFLP 法检测，可鉴定出API 生化系统不能检测出的毛孢子菌，结合D1/D2 区域的测序，鉴定出Trichosporon gracile。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplifi cation，LAMP），是针对靶基因的6 个区域设计4 对特异引物，在链置换DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60 ～65℃恒温扩增，15 ～60 min 即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。Kasahara 等[27]针对毛孢子菌26S 和5S rRNA 基因间隔中的IGS1 区域设计LAMP 引物，可以在1 h 内检测并鉴别出1 ml 培养液中1 ～103个菌量的毛孢子菌或念珠菌，并成功鉴定出阿萨希毛孢子菌和粘性毛孢子菌。

3 展望

近年来，随着侵袭性毛孢子菌病报道的病例数逐年增多，越来越多的研究开始关注于该疾病的诊断与治疗。侵袭性毛孢子菌病病死率高，因此该病的早期诊断具有重要的临床意义。非培养检测方法包括：血清学检测、PCR 技术等均具有各自的优势。血清学检测具有简便快速的特点，但检测方法的敏感性和特异性尚需进一步研究与证实。相比之下，PCR 及其相关技术更可快速、敏感、特异的检测出病原菌并鉴定菌种，是快速早期诊断发展的主流。但 PCR 过程中也存在一些问题，如检测过程缺乏规范化，极少量的污染便可出现假阳性结果，检测的敏感性和特异性报道不一，PCR 结果必须结合患者的临床表现和其他的检查结果，才能作出正确的判断。侵袭性毛孢子菌病中重要致病菌阿萨希毛孢子菌的全基因组序列已经破译[28]，发现更特异的检测基因靶位，对于该疾病的更多深入研究将会进一步推动早期诊断技术的发展。

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