虾类原肌球蛋白提取和活性的保持

李　洋，薛　璐，胡志和，吴子健，王丽娟

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

虾类原肌球蛋白提取和活性的保持

李洋，薛璐*，胡志和，吴子健，王丽娟

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

蛋白质分离纯化的主要目的是研究其结构和理化性质，因此在分离纯化过程中应尽量保持原有的结构和性质。本文主要综述了甲壳类动物的主要过敏原-原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）的结构，以及影响其结构稳定性的因素。同时讨论了分离纯化的方法及条件对原肌球蛋白结构和过敏原活性的影响，为提取高纯度且保留原有结构和活性的原肌球蛋白提供参考。

原肌球蛋白，纯化，结构，过敏原活性

蛋白质分离纯化的主要目的是研究其结构和理化性质。因此，在进行蛋白质纯化的过程中，应尽量采用较温和的方法和条件，保留其原有的结构和性质。原肌球蛋白已经被确认为是甲壳类动物的一个主要过敏原［1-2］，已成为甲壳类水产致敏性消减研究的热点。因此，如何获得高纯度，且能够保留原有结构和性质的原肌球蛋白（Tropomyosin，TM），对研究原肌球蛋白的结构及致敏性具有重要的意义。本文以虾主要过敏原原肌球蛋白为对象，综述了其结构和在提取纯化中影响其过敏原性的因素及相应的措施，介绍了近年来原肌球蛋白提取纯化的方法及活性保持的效果，为提取高纯度且保留原有结构和活性的原肌球蛋白提供参考。

1　虾原肌球蛋白

原肌球蛋白是甲壳类动物的主要过敏原，其中原肌球蛋白Pen a1研究较为清楚。原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）是α螺旋的二聚物，含有极少的β-折叠和β-转角等结构，两条α链形成一个卷曲螺旋结构，位于肌动蛋白细丝的螺旋链上，它们首尾相连，形成连续的单元［3］。研究显示，其分子量在32～38ku，等电点在4.5左右，是一种酸性糖蛋白，含糖量约为2.9%，溶于水及盐溶液，具有热稳定性［4-6］。它的功能是调节肌动蛋白-肌球蛋白相互作用和稳定肌动蛋白纤维结构。原肌球蛋白几乎存在于所有的真核细胞中，是多样化的组织蛋白，在不同动物组织中有不同的亚型。

另外，甲壳类动物的原肌球蛋白具有相对保守的氨基酸序列，虾原肌球蛋白包括中国对虾（Pen a1）、印度对虾（Pen i1）、斑节对虾（Pem 1）、刀额新对虾（Met e1）、凡纳滨对虾（Lit v1）的序列相似度高达93%～99%［7］。经过同源性的比较，可以获得蛋白质可能具有的功能，及某些相似的特点和性质［8］。不同亚类间的原肌球蛋白的抗原表位区域虽分布不同，但其抗原决定簇片段具有交叉重叠部分，过敏者IgE与不同甲壳动物的原肌球蛋白会有很高的交叉反应，甚至与尘螨、蟑螂等无脊椎动物的原肌球蛋白也具有交叉反应。

2　影响原肌球蛋白结构与其免疫活性的因素

稳定原肌球蛋白结构的因素有蛋白质中的氢键及糖基、疏水作用、范德华力、静电作用力等［9］，这些因素有着不同的作用点。Zheng等利用3种免疫信息学工具预测了斑节对虾原肌球蛋白的潜在IgE线性表位，确定其过敏原表位大部分位于原肌球蛋白的螺旋结构内［10］。破坏蛋白抗原决定簇的序列会引起其免疫活性的变化。孙佳益［11］利用胰蛋白酶处理南美白对虾的原肌球蛋白后，western blotting结果中无36ku的特异性条带，说明当过敏原蛋白抗原决定簇序列受到破坏时，过敏原蛋白的免疫活性会丧失。

糖链的存在会提高蛋白的热稳定性及过敏原性，王晓斐［12］发现中国对虾主要过敏原Pen c1去糖基前的热变性温度为136.60℃，而去糖基后的热变性温度为115.55℃。随后，采取酶切法去糖基后，经ELISA检测，发现其免疫活性略有降低。同时，美拉德反应使原肌球蛋白发生糖基化后，免疫活性也会明显降低［13］。

疏水作用使蛋白质在水溶液中埋藏非极性表面，有利于其保持热稳定性，从而稳定蛋白质的结构［14］。顾可飞等经辐照处理对虾主要过敏原Pen a1后，发现其疏水基团暴露，当达到一定剂量（7kGy）时，部分疏水基团被破坏或受到掩盖，蛋白质发生分解、交联等变化，从而丧失了活性［15］。随着离子强度的增强，原肌球蛋白与细肌丝中肌钙蛋白之间的结合力也会减弱，不利于其保持稳定性［16］。

此外，在原肌球蛋白提取纯化的过程中，提取温度、提取溶剂、储藏时间等均可能对以上因素造成影响，从而影响原肌球蛋白的活性保持。

3　虾过敏原蛋白的提取纯化方法及活性保持

3.1原肌球蛋白的提取及纯化方法

1981年Hoffman等［17］最先报道了棕虾（Penaeus aztecus）中引起过敏反应的过敏原是分子量为36ku的蛋白质。接着Daul等［18］发现36ku的蛋白质是棕虾的主要过敏原，命名为Pen a1。1993年Shanti等［19］分离出印度对虾（Panulirus stimpsoni）的主要过敏原Sa-II，为34ku的原肌球蛋白，含有300个氨基酸残基，并证实其IgE结合表位为肽链的50～66和153～161片段。2010年Rahman等［20］分离了黑虎虾（Penaeus monodon）的具有免疫活性的主要过敏原，为分子量33ku的原肌球蛋白。2012年Mohamad Yadzir等［21］分离了罗氏沼虾（giantfreshwater prawn）中分子量为36ku的主要过敏原原肌球蛋白。同年，Myrset等［22］重组了北方甜虾的原肌球蛋白Pan b1，并用于诊断和进一步研究原肌球蛋白变应原性和特定的免疫治疗。近年来，张华、吴序栎等［23-24］分离纯化了刀额新对虾、斑节对虾的主要过敏原，经过western blotting反应鉴定，为原肌球蛋白。张在军等［25］分离纯化了河虾的主要过敏原原肌球蛋白，并验证了其sIgE结合活性。

目前根据已有不同来源的原肌球蛋白的提取、纯化研究，原肌球蛋白的提取纯化分为三个步骤：首先是虾纤维蛋白粉的制备，将去头、去壳、去尾的新鲜虾体组织在一定离子强度的缓冲液中（pH7.0～7.5），低温下匀浆，经过缓冲液的重复洗涤，离心收集沉淀，去除大部分肌浆蛋白；然后用预冷（-20℃）过的有机溶剂，如乙醇、乙醚或丙酮等，重复抽提，离心或用纱布过滤，去除脂肪；同时可以沉淀一些不需要的蛋白，将所得沉淀经自然风干得到虾纤维蛋白粉末［26-28］。早在1993年，Shanti等［19］就利用乙醚反复处理虾肉，得到虾纤维蛋白粉末。2006年Fuller等［29］用低盐缓冲液（内含有20mmol/L KCl、1mmol/L KHCO3、0.1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L DTT）除去匀浆后的中国对虾虾泥中的肌浆蛋白，所收集得到的沉淀先用预冷的乙醇洗涤两次，再用预冷乙醚处理两次，所得沉淀经自然风干就可获得中国对虾纤维蛋白粉。在采取以上措施时，原肌球蛋白的活性能够得到保留。因此以虾纤维蛋白粉为原料进行原肌球蛋白的浸提，采用pH为7.0～8.0的含1mol/L KCl的缓冲液进行反复浸提，离心取上清，合并浸提液即为蛋白提取液［30-32］，增加提取次数可获取更多的样品。另外，因原肌球蛋白的结构具有较好的热稳定性，也可通过加热获得原肌球蛋白粗提液。林江伟等［33］将新鲜的克氏原螯虾肉在磷酸缓冲液（PBS，10mmol/L，pH=7.0，含3%的NaCl）中捣碎，沸水浴15min，获得了虾蛋白提取液，western blotting中，与13份甲壳类过敏患者血清呈阳性反应，反应率为100%。

第二步是以蛋白粗提液为原料，采用硫酸铵盐析法或等电点沉淀法获得原肌球蛋白粗品。在此过程中，硫酸铵盐析不仅能获得一定纯度的原肌球蛋白，还可保持过敏原的活性。张在军［34］通过饱和度为90%硫酸铵盐析，获得粗提的原肌球蛋白，免疫斑点法（Dot-ELISA）证明目的蛋白能与特异性IgE反应。陈同强等［35］分离纯化了中国龙虾的主要过敏原，利用饱和度为45%硫酸铵盐析，然后将沉淀复溶，调节pH至4.5，进行等电点沉淀，获得原肌球蛋白，Dot-ELISA结果显示其具有较高活性。林江伟等［33］将克氏原螯虾蛋白提取液进行饱和度为40%～60%的硫酸铵盐析，取沉淀复溶并进行沸水浴，收集上清液即为原肌球蛋白，western blotting实验中，呈明显阳性反应。刘光明等［36］经等电点沉淀及饱和度为41%的硫酸铵盐析，沉淀出了南美白对虾的原肌球蛋白，western blotting实验中，与9例虾过敏人血清均有反应。硫酸铵盐析取沉淀后，可用相同浓度的饱和硫酸铵溶液进行洗涤，去除一些杂蛋白［37］。

纯化的最后一部分通常是利用层析技术进行原肌球蛋白的纯化，如分子筛层析、离子交换层析、HPLC技术。Emoto等［38］利用反相高效液相色谱（TSKgel ODS-120T柱）除去美国龙虾原肌球蛋白中的少量杂质。Rahman等［39］利用强碱性阴离子交换层析柱纯化了黑虎虾的主要过敏原。黄建芳等［40］经过葡聚糖G-50凝胶层析及DEAE阴离子交换层析，纯化了河虾的主要过敏原原肌球蛋白，纯度达到94.2%，且western blotting阳性反应率为63.6%，过敏原活性相对最强。

另外，黄素文等［41］根据甲壳类的泛过敏原原肌球蛋白基因的高度保守性设计简并引物，通过RTPCR克隆出淡水小龙虾虾肉中过敏原原肌球蛋白的全长基因。并将该基因连接入大肠杆菌，经诱导表达、Ni2+亲和层析柱纯化，获得重组原肌球蛋白纯品Pro c1，经过western blotting鉴定，与过过敏人血清反应率为80%，具有良好的免疫活性。

目前用于制备原肌球蛋白粗品的方法较为成熟，人们都是利用前面所述的方法来制备虾纤维蛋白粉以及盐溶液浸提，盐析沉淀可分离得到有一定纯度的原肌球蛋白粗品。在此过程中，均采取低温操作，根据原肌球蛋白盐溶的特性选择适宜浓度的盐溶液作为提取剂，盐析时使用硫酸铵粉末或饱和硫酸铵溶液，获得具有一定纯度及活性的原肌球蛋白。在利用层析技术进行纯化时，通常将离子交换与凝胶过滤层析相结合，凝胶过滤层析复性蛋白质操作步骤简单，介质和蛋白质之间没有吸附，影响因素也相对较少［42］，有利于蛋白质活性的保持。HPLC法所用的仪器、耗材昂贵，制备规模小且样品不易回收，蛋白的免疫活性难以保持。另外，利用分子克隆法获得的样品，又可能存在生物安全性问题。

3.2原肌球蛋白活性保持的方法

采取以上措施进行原肌球蛋白提取纯化时，为了保持原肌球蛋白的过敏原活性，可以采取以下措施。

在对虾组织进行预处理，使其充分释放出提取物时，所有的步骤在低温条件下操作。因为高温水溶液条件下，蛋白酶的存在会造成Asp的肽水解、Gln和Asn侧链的脱氨基、Cys侧链的β-去除及二硫键交换，从而对肽链再折叠产生极其严重的影响［43］，同时剧烈的搅拌也会造成蛋白活性的损失。研究发现加热处理5min后的过敏原蛋白免疫活性降低了53%。尽管原肌球蛋白因具有异常稳定的α螺旋而具有热稳定性［44］，但在蛋白质提取过程中，加热与否及加热的程度仍会通过改变其空间构象来影响蛋白的提取率及活性。

在蛋白浸提时，不同溶剂的提取效果不同，可以根据蛋白质的可溶性及酸碱性等具体情况来选择提取液［45］。大部分蛋白都溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质可溶于乙醇、丙酮等有机溶剂中。因此，在实际操作中，选择适合的提取液不但可达到提取去杂的目的，还有利于保持蛋白的天然结构。原肌球蛋白为可溶于水溶液及盐溶液，提取过程中，为了提高提取率和保持蛋白的活性，可加入一些保护剂，如二硫苏糖醇（DTT），它可以打开蛋白质中半胱氨酸之间形成的二硫键，防止形成晶体蛋白高分子聚合物，使蛋白质保持原有的构象［46］。吴丽莎［47］通过间接ELISA检测不同提取液对蛋白活性的影响，发现加入DTT的提取液抽提蛋白的过敏原性显著（p＜0.05）高于未加入DTT的提取液抽提的蛋白。同时，加入低浓度的钙离子也可以稳定原肌球蛋白结构，有利于保持其天然构象［48］。

原肌球蛋白粗品通常是利用盐析法，该过程中盐的种类及酸和盐的加入顺序会影响盐析的效果。虾蛋白提取中常用的是硫酸铵，因为饱和硫酸铵溶液的pH在4～5之间，靠近原肌球蛋白的等电点（pI4.6）。且硫酸铵对蛋白质有相当好的稳定作用，溶解度很大，用量少，而Na2SO4饱和溶液则相反。NH4NO3的溶解度虽然很大，但盐析时比（NH4）2SO4、Al2（SO4）3需要的量大，这可能是因为NH4NO3在溶液中电离出的电荷数少［49-50］。在盐析过程中，为了避免蛋白溶液体积的变化，可以选择缓慢的加入硫酸铵粉末，缓慢搅拌，以免造成溶液局部盐浓度过高而引起蛋白的变性。为了更好的保持过敏原的活性，在允许蛋白溶液体积变化时，也可选择滴加饱和硫酸铵溶液，相比加入硫酸铵粉末更温和。研究发现，提高盐析次数可达到更好的纯化目的，并且蛋白活性不会有太大损失［51］。另外，获得的过敏原提取物最好低温保存，避免反复冻融而引起过敏原活性的变化。研究表明，获得的虾过敏原提取物在-20℃和-80℃储存5周时，蛋白浓度下降了5.71%和5.00%，可能是因为从虾中提取的蛋白，本身就含有分解蛋白的酶，且冷冻、解冻速度影响冰晶的形成从而影响蛋白含量［52-53］，但是提取物的过敏活性保持不变。除了储存时间，蛋白提取物的反复冻融也会影响蛋白的活性，在-80℃和-20℃冻融循环4次时，主要过敏原条带会发生降解［54］。

最后，利用层析技术纯化蛋白不仅会使部分蛋白损失，层析的溶液环境和固相介质也会引起蛋白质的结构变化，虽然结构变化了的蛋白质也可能重新折叠恢复活性，但是部分天然的蛋白质可能会降低活性甚至完全失去活性［55］。因此，层析过程中缓冲体系、流速、上样量的选择就显得尤为重要。研究显示，在凝胶层析过程中，大体积低蛋白质浓度进料时其复性率高，同时还发现较慢的洗脱流速能够减少蛋白质聚集的机会［56］。另外，层析和盐析纯化的蛋白，都需要透析、冷冻干燥后回收，而在冷冻干燥过程中，蛋白质可能在冻结过程中变性。大多数研究者认为蛋白质分子周围分布着多层水分子，只要蛋白质分子表面的单层水分子没有冻结，则蛋白质就不会变性；反之，蛋白质就会变性［57］。因此在冷冻干燥蛋白质的过程中，可以加入保护剂，防止由于蛋白质表面的单层水分子破坏而引起的蛋白质变性。常用的保护剂种类有多羟基化合物、糖、蛋白质、聚合物、氨基酸、盐、胺、表面活性剂等［58］。

4　结论

原肌球蛋白结构性质的深入研究和对其提取纯化过程中活性保持因素的了解，可为揭示过敏反应与蛋白结构之间的关系提供一定的参考。然而，由于不同品种虾的过敏原之间存在差异，对不同来源的过敏原的生物化学本质、组成、含量等的认识还不全面，获得具有活性的高纯度原肌球蛋白则需要以提取及纯化技术的改进和提升为基础。

目前国内外研究集中于对海虾主要过敏原原肌球蛋白的结构及表位确定方面，关于过敏原刺激机体产生过敏反应的具体机理及非主要过敏原与主要过敏原关系的研究较少。纯化过程中非主要过敏原的减少或消失，对主要过敏原免疫活性变化的影响等方面仍需要进行研究。

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Extraction and activity remained of shrimp tropomyosin

LI Yang，XUE Lu*，HU Zhi-he，WU Zhi-jian，WANG Li-juan
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

The main purpose of the separation and purification of proteins was to study its structure and physicochemical properties，so the original structure and properties should be kept during the separation and purification.The paper reviewed the structure of major allergen of crustaceans-tropomyosin（Tropomyosin，TM），and the factors of effecting its structural stability.And the effect of separation methods and conditions on TM’s structure and allergen activity was also discussed，which provided a reference for the extraction of tropomyosin with high purity and original structure and activity.

tropomyosin；purification；structure；allergen activity

TS254.1

A

1002-0306（2015）10-0395-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.075

2014－09－11

李洋（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

薛璐（1976-），女，博士，副教授，研究方向：专用功能食品。

国家自然科学基金面上项目（31271841）；天津市高等学校创新团队项目（TD12-5049）。