加工导致的花生过敏原蛋白结构变化及其对性质的影响

赵瑞芳,吴志华,连 君,詹少德,王 娟,姚志文,陈红兵,袁娟丽

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学中德联合研究院,江西南昌 330047;3.南昌大学新闻与传播学院,江西南昌 330031;4.南昌航空大学工程训练中心,江西南昌 330063;5.南昌大学药学院药理教研室,江西南昌 330006)

加工导致的花生过敏原蛋白结构变化及其对性质的影响

赵瑞芳1,2,吴志华1,2,连 君1,2,詹少德1,2,王 娟3,姚志文4,陈红兵1,2,袁娟丽1,5,*

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学中德联合研究院,江西南昌 330047;3.南昌大学新闻与传播学院,江西南昌 330031;4.南昌航空大学工程训练中心,江西南昌 330063;5.南昌大学药学院药理教研室,江西南昌 330006)

花生是世界粮农组织(FAO)认证的八大过敏食物之一,花生可导致严重的过敏反应,甚至危及生命。由于花生作为食物配料有广泛的应用,人们对花生过敏越来越关注。本文对加工后花生过敏原蛋白结构变化与性质变化之间的关系研究进行了综述,为探索加工定向改变花生过敏原蛋白的结构和性质提供方向。

花生,过敏原,结构,致敏性

随着人们生活质量的提高,食物过敏等食品安全问题已成为全球关注的问题。据世界粮农组织(FAO)1995年报告,90%以上的食物过敏是由牛奶、鸡蛋、鱼、贝壳水产品、花生、大豆、坚果类和小麦引起,花生属于这八大食品之一,是重要的食物过敏原[1]。目前发现的花生过敏原蛋白有12种,可以归类为4种常见的食物过敏原家族:Cupin超家族(Ara h 1,3),醇溶蛋白超家族(Ara h 2,6,7,9),抑制蛋白家族(Ara h 5),Bet V1同源蛋白(Ara h 8)以及另外两种:Oleosin油质蛋白(Ara h 10,11),Defensin抵抗素(Ara h 12,13)。食物过敏原中能够被50%以上的病人的血清所识别的就被认为是主要的过敏原,其中Ara h 1和Ara h 3、Ara h 2和Ara h 6都被认定是花生中主要的过敏原蛋白[2]。

作为食品的花生通常是经过了加工处理,而花生制品的加工工艺繁多,不同的加工方式会不同程度地改变花生过敏原蛋白的数量和结构,进而影响其性质。对于加工引起的过敏原蛋白性质的变化,现阶段关注较多的包括致敏性、分子聚集特性,消化吸收性以及其它加工特性(如乳化性、起泡性等)。研究试图通过考察结构变化引起性质变化的规律,探索不同加工方法对花生过敏原蛋白性质,尤其是致敏性的定向影响。

1 致敏性

加工导致的过敏原结构变化,直接影响到它们的致敏性。比如Hansen等[3]的研究表明,热处理可以导致蛋白质变性破坏其构象性表位,因此,蛋白质变性可以解释榛子粉类过敏原加热后90%的免疫反应性丧失的现象。然而,Mondoulet等[4]对花生进行烘焙处理,发现烘焙后花生蛋白的致敏性却增强了。这可能是由于烘焙导致花生蛋白与还原糖发生美拉德反应,产生新的免疫反应性结构,增强其致敏性;同时Ara h 2可以保护Ara h 1不被胰蛋白酶降解,而烘焙又可以提高这种保护作用。Starkl等[5]也做了烘焙加工,发现Ara h 2分子可以发生交叉连接,形成结构更稳定的三聚体或六聚体等复合物,与IgE的结合能力增强。

Beyer等[6]的研究表明,在对花生进行煎炸(120 ℃)的加工中发现,煎炸会引起Ara h 1二级结构中β-结构舒展,但是ELISA实验表明Ara h 1引起过敏的能力并没有被影响。而煎炸后的花生中过敏原蛋白Ara h 1的提取率却逐步降低了,150 ℃以上时基本降为零,这可能是由于加热引起蛋白质的聚合引起的,这种聚合又减少了与IgE结合的过敏原数量,使得蛋白的致敏性下降。Blanc等[7]研究也表明,花生经煎炸后所含的Ara h 1单体和三聚体数量减少,从而降低Ara h 1与IgE的结合能力,影响其致敏性。

水煮也被报道可以降低花生的致敏性,Mondoulet等[4]对花生进行了水煮加工,他认为水煮后花生致敏性的降低是过敏原数量损失导致的,与其结构变化没有关系。用ELISA法检测表明,确实有部分过敏原蛋白进入到了水煮液中,这与Beyer等[6]的研究结果一致。然而也有研究表明,结构上的变化也可以导致水煮花生致敏性的降低,Schmitt等[8]的研究发现,水煮过程中过敏原蛋白有较少的聚集体形成,且这种聚集体不溶于水,从而抑制或降低了美拉德反应,减少了免疫反应性结构的形成,进而降低其致敏性。Blanc等[7]也发现,水煮加工后Ara h 1聚集起来,蛋白的二级结构部分丢失,这也导致致敏性降低。

高压微射流可以改变过敏原蛋白二级结构中的α-螺旋结构,从而影响其致敏性。Hu等[9]用高压微射流技术处理花生蛋白 Ara h 2,用圆二色谱法和ELISA实验发现α-螺旋含量降低的同时检测到的抗原性也显著降低,这可能是由于位于过敏原蛋白α-螺旋位置处的IgG结合表位被破坏或掩盖。Cabanillas等[10]用高压处理烘焙过的花生也得到了同样的结果,证明了高压可以通过破坏或者掩盖位于α-螺旋区域的IgE结合表位降低致敏性。另外,Luo等[11]是利用γ辐照Ara h 6过敏原蛋白发现,辐照也可以使蛋白质二级结构中α-螺旋损失,同时免疫印迹法和间接ELISA法检测到其与IgG结合的能力降低,进一步证明了α-螺旋结构与花生过敏原致敏性之间密切的关系。Hu等[9]的研究表明超高压微射流处理还可以破坏Ara h 2的二硫键,二硫键对维持IgG或IgE结合表位的构象有重要的作用,这也是超高压微射流降低其致敏性的另外一个原因。

酶消化是近几年来研究花生过敏原致敏性的新方法之一,主要是将蛋白水解为小的片段,酶作用时可能破坏其过敏原表位。为了研究过敏原蛋白在人体内消化后的致敏性变化情况,实验室经常使用胃蛋白酶和胰蛋白酶模拟人体胃液和肠液消化。比如,Yu等[12]利用α-糜蛋白酶和胰蛋白酶水解烘烤花生中Ara h 1和Ara h 2蛋白,并运用ELISA实验和免疫印迹法分析发现水解后其致敏性显著降低。主要是两种酶同时作用时,由于酶作用位点不同,它们能够以互补的方式水解过敏原蛋白,增强水解效果。Ara h 1和Ara h 2水解为小的片段,在可溶性蛋白中完整形式的Ara h 1和Ara h 2含量几乎降为零。Eiwegger等[13]先利用胃蛋白酶消化花生粗蛋白,再用十二指肠液消化,胃消化后保留的肽段在十二指肠消化后会进一步被分解,并运用人血清的免疫印迹实验、淋巴细胞免疫刺激实验评估发现胃十二指肠消化后,即使没有完整的蛋白存在,小的片段仍然具有致敏的潜力。酶作用时会导致部分过敏原表位的破坏,但是同时暴露出了天然蛋白结构内部的过敏原表位,这使得致敏性变化不大。而王金水等[14]是使用枯草芽孢杆菌对冷榨花生蛋白粉进行液态发酵,由SDS-PAGE法发现高压与发酵相结合对花生蛋白有着很好的降解效果,进而可以降低其致敏性。

酶交联是现代食品加工的一种新方法,过敏原蛋白在交联和聚集的过程中,结构的变化也可能导致过敏原表位被掩盖或改变进而影响其致敏性。比如,Chung等[15]分别将生花生和烘焙花生与过氧化物酶(OPD)混合,IgE的结合能力实验表明烘焙花生交联后其致敏性降低。从SDS-PAGE电泳结果可以明显的发现,烘焙花生中Ara h 1,Ara h 2过敏原单体的量显著减少,而且有蛋白质聚合体的形成,而生花生中的过敏原蛋白由于其过氧化物酶的交联位点(酪氨酸)隐藏,蛋白质之间不发生交联反应而致敏性基本不受影响。而Clare等[16]利用转谷氨酰胺酶交联Ara h 1发现,Ara h 1能够交联形成聚合物,但是通过ELISA实验发现该聚合物与IgE的结合能力并没有发生显著变化。除了酶交联外,花生过敏原也可以与其它物质作用形成聚合物,如Chung等[17]将花生可溶性过敏原与植酸非共价结合,用间接ELISA法测定发现,IgE结合能力没有变化,主要是由于没有改变IgE结合位点,但是通过形成复合物减少了过敏原含量,也降低了致敏性。

许舒婷等[18]用微粒辐射产生的电子辐照处理花生粗分离蛋白,处理后的蛋白质二级、三级结构遭到破坏,引起分子变形、凝聚、粘度下降,从而导致过敏原溶液的浓度改变,进而影响其致敏性。

加工导致的过敏原蛋白致敏性的变化可由多种因素引起,例如加工使得二级结构中α-螺旋处结构发生变化,可能导致该处的IgG结合表位被破坏或掩盖,加工时蛋白之间发生聚集也可能掩盖表位或产生新的免疫反应性结构,从而引起致敏性的变化。这些致敏性的改变,主要与过敏原表位结构自身的变化有关。

2 分子的聚集特性

蛋白质是由氨基酸分子由肽键相互连接而成的高分子化合物,不同的加工条件可能导致花生中蛋白质分子发生不同程度的聚集。现有的实验研究表明,高度聚集蛋白质的形成可能是通过包括二硫键在内的共价交联,以及诸如氢键、盐桥,尤其是疏水相互作用等的非共价相互作用,形成较大的聚集体[19]。

已有报道关注了这些变化,例如,Maleki等[20]采用烘焙方式处理花生,发现在烘焙过程中花生中的蛋白质会与还原糖发生美拉德反应,形成一种结构多样的复合物进而改变其聚集性。Vissers等[21]对分离纯化的Ara h 1、Ara h 2/6也做了烘烤的研究,从SDS-PAGE电泳实验以及动态光散射实验发现,加入葡萄糖加热时,有多肽聚合物产生。溶解性是蛋白质其他功能特性的基础,溶解度也可以用来表征花生分离蛋白的聚集程度[22]。Schmitt等[8]分别对花生蛋白中可溶的和不可溶的部分进行水煮处理,发现水煮使得整体蛋白的溶解性降低,说明水煮过程中过敏原蛋白可能发生了聚集,产生了大的复合物从而降低溶解度。顾炜等[23]用喷射蒸煮处理花生分离蛋白,并用SDS-PAGE电泳法发现电泳条带上端有大分子量的聚合物产生。荧光光谱分析发现,经过处理后花生分离蛋白完全变性,原本处于蛋白质内部的疏水氨基酸残基伸展,暴露于溶剂中,可能正是由于这些结构的变化引起了蛋白质聚集特性的改变。

酶交联主要利用一种或多种酶催化蛋白质内部多肽链之间或者是蛋白质分子之间形成新的共价键,从而交联形成大的聚合物。通过蛋白质交联可改变食品组织结构和功能性质,因此蛋白质交联在食品中有较广阔应用前景[24]。

Radosavljevic等[25]利用多酚氧化酶交联花生粗蛋白,再以扫描电子显微镜和电泳法结合观察发现,多酚氧化酶处理可以促进花生中主要过敏原蛋白发生交联产生高分子量的聚合物。Clare等[16]用转谷氨酰胺酶交联花生蛋白发现,Ara h 1基本都能被交联形成聚合物,而Ara h 2却很难发生交联反应。Ara h 2中的转谷氨酰胺酶的酶催化位点之一赖氨酸可能被折叠掩盖,因而较难发生交联反应。Chung等[26]将花生粗蛋白与酚类物质(苯酚树脂、咖啡酸、阿魏酸)作用,运用SDS-PAGE电泳法检测发现,酚类物质可以与花生蛋白结合形成复合物,并且证实了聚合物中有两种主要的花生过敏原蛋白存在。

廖玉等[22]利用脂肪氧合酶催化亚油酸氧化的反应体系对花生分离蛋白进行不同程度的氧化修饰,运用激光纳米粒度测定仪测定聚集性的变化发现,随着氧化程度的加深,花生蛋白粒径增大。这可能是由于氧化引起疏水基团暴露,又由于暴露的疏水基团的相互作用蛋白质生成可溶性聚集体,平均粒径变大,并随着进一步的氧化最终生成不可溶性聚集体。

酶促交联,热加工及氧化修饰等加工方式都可以改变过敏原蛋白的聚集特性。酶可以促进蛋白质内部多肽链之间或者是蛋白质分子之间形成新的共价键,从而形成大的复合物,而热加工和氧化修饰都可能引起蛋白内疏水基团暴露,从而增强蛋白之间的相互作用进而改变聚集状态。

3 消化吸收性

高压引起的结构的变化可以改变过敏原蛋白的消化性。Cabanillas等[10]对花生进行烘焙和高压烘焙处理发现,与单独烘焙花生相比,高压处理后的烘焙花生蛋白更易被胰蛋白酶消化。圆二色谱实验显示在高压条件下花生蛋白结构发生了伸展,这使得蛋白更易被消化,且加热可以增强花生蛋白对胰蛋白酶的敏感性。另外,Hu等[9]做了高压微射流的研究,发现高压可以通过破坏二硫键来增强蛋白的消化性,MarzbanG等[10]的研究也证明,含有IgE表位的碎片可以抵抗酶的消化,但是当其二硫键被破坏时,这些碎片就会被快速消化。

多个研究表明,热处理也可以通过改变酶作用位点影响过敏原蛋白的消化性。例如,Yu等[27]的研究表明,与生花生相比,烘焙花生中的过敏原蛋白Ara h 1、Ara h 2对α-糜蛋白酶更加敏感。首先烘焙可以破坏酶抑制剂,且由于α-糜蛋白酶的结合位点是疏水性的,烘焙可以暴露特定的疏水性氨基酸(酪氨酸,苯丙氨酸,色氨酸等),增多了α-糜蛋白酶的结合位点进而可以增强消化性。烘焙过程中与还原糖的美拉德反应也会改变过敏原蛋白的酶作用位点,Teodorowicz等[28]就研究了加葡萄糖和不加葡萄糖的情况下烘焙对Ara h 1胃蛋白酶消化性的影响,并利用裂解肽段的程度来评估水解的程度。研究表明,葡萄糖不存在时加热没有改变Ara h 1的胃蛋白酶水解度,而加入葡萄糖后由于Ara h 1的糖基化反应,改变了Ara h 1构象中的胃蛋白酶酶作用位点,水解度显著降低,且美拉德反应的高级阶段可以促进Ara h 1发生交联反应[29-32],水解酶不能接近酶交联位点的多肽而进一步阻止水解作用[33]。

过敏原蛋白的抗消化性与二硫键有着密切的关系,Shi等[34]的研究发现胃蛋白酶水解后Ara h 2仍具有较强的抗消化性,这主要是由于Ara h 2结构中的八个半胱氨酸残基及二硫键可以稳定α-螺旋等核心结构,抵抗酶水解[35]。Koppelman等[36]也利用胃蛋白酶消化花生过敏原蛋白得到了同样的结果;并且发现Ara h 1和Ara h 3在较低浓度胃蛋白酶作用下就能迅速的被降解,并用SDS-PAGE电泳法证实,分子间不存在二硫键,三聚体和低聚物[37-38]的形成由非二硫键连接不能形成稳定的抗消化结构,这与Thomas[39]的研究结果一致。

Teodorowicz等[40]向纯的Ara h 1蛋白中混合适量葡萄糖使其发生蛋白糖基化反应。用Caco-2细胞模型测定发现不经过任何处理的Arah 1蛋白能够抑制Caco-2细胞的增殖以及白细胞介素-8的分泌,糖基化后的Arah 1抑制能力减弱,且经胃蛋白酶水解发现,水解前其抑制效果比水解后明显,这说明可能是较大的结构起了重要的抑制作用。

4 其它性质

花生过敏原蛋白的溶解性、乳化性、乳化稳定性、起泡性等其它性质也会随着花生加工的不同而发生不同程度的改变。

Liu等[41]在60 ℃下分别干热处理花生分离蛋白1、4、7 d,利用差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry/DSC)、发射荧光光谱法、圆二色谱法研究发现,热处理后花生分离蛋白由于与葡萄聚糖发生了美拉德反应,限制了蛋白质间的相互作用,进而提升其溶解性和稳定性;溶解性的提升又使得蛋白质分子能够快速的转移到水油交界面进而提升其起泡性,而作为非表面活性的亲水性多糖,葡聚糖可以显著的提升蛋白质的泡沫稳定性。

任娇艳等[42]通过转谷氨酰胺酶对低温花生粕分离蛋白进行交联改性,发现交联反应后花生蛋白的功能特性发生改变。随着交联程度的增加,高分子不溶聚合物的生成以及蛋白结构的变化导致蛋白质溶解性下降;交联后其乳化性和乳化稳定性提高,但交联时间过长又会导致其制备的乳状液乳化活性及稳定性显著降低。DSC测定热稳定性表明,交联处理后花生分离蛋白热稳定性提高,这可能主要归因于转谷氨酰胺酶催化的交联反应产生了大量的高能异肽共价键。

涂宗财等[43]对花生蛋白进行高压微射流处理发现,花生蛋白质在压力猛烈释放过程中一些对压力敏感的非共价键(氢键、离子键和疏水键)受到了强烈的影响,导致蛋白质的微细结构发生变化,粒度尺寸变小和分布范围集中,进而改变了其溶解性。压力使得花生蛋白体积减小,疏水结构暴露出来,蛋白质表面疏水性增强,进而提升了其乳化性和起泡性。

Hu等[44]不仅研究了单独的微射流处理和转谷氨酰胺酶交联,还将交联处理与微射流相结合作用于花生蛋白。作者运用傅里叶变换红外光谱和圆二色光谱测定发现,单独的微射流处理或者转谷氨酰胺酶交联可以引起花生分离蛋白结构的展开,进而使得α-螺旋和β-转角减少,β-折叠和随机卷曲增多,花生分离蛋白的溶解性、乳化性以及表面疏水性显著提升,并且作者发现混合两种加工方式处理会使得花生分离蛋白形成更松散的结构,进而导致花生蛋白的功能特性更显著改善。

一些化学修饰的方法同样可以改变蛋白质的功能特性,如蛋白质磷酸化已经被认为是提高蛋白功能特性的有效手段,熊柳等[45]的研究表明,磷酸化改性后花生蛋白的乳化性、乳化稳定性、泡沫稳定性也都有不同程度的提高。Zhao等[46]用碱性蛋白酶水解花生分离蛋白发现,水解使花生分离蛋白的构象和功能特性得到显著地改善。与花生分离蛋白相比,花生分离蛋白水解产物有更多松动的三级结构,并表现出较好的热稳定性,溶解性和凝胶形成能力。

5 展望

花生过敏反应是IgE介导的Ⅰ型超敏反应,花生过敏反应可发生在各个年龄段,轻可出现口腔粘膜过敏、皮肤荨麻疹等,重可出现危及生命的严重咽喉水肿、急性哮喘、过敏性休克,甚至导致死亡[47],这限制了花生在食品工业中的应用。

不同的加工方法对过敏原蛋白性质的影响各不相同,但是这些性质的变化都与内部结构变化有关,结构的变化与性质变化之间的联系是我们定向改变蛋白质性质的基础。蛋白质二级结构的变化可以直接影响致敏性,尤其是α-螺旋量的减少与致敏性的降低有密切的关系,这主要是由于α-螺旋处的过敏原表位被破坏或掩盖,聚集也能掩盖α-螺旋处的过敏原表位,导致致敏性降低。加工改变蛋白质高级结构,暴露消化酶作用位点,也会增强过敏原蛋白的消化性,降低过敏原的致敏性。例如,二硫键对抵抗酶水解起着重要的作用,二硫键被破坏后,蛋白质在人体内的消化性增强,潜在致敏性降低。

加工引起的蛋白质结构变化除了可以直接影响致敏性之外,聚集性,消化吸收性等其它性质的变化也会间接影响致敏性。通过共价键或非共价键交联作用可以改变蛋白质的聚集性,这个过程中可能产生新的免疫反应性结构,增强过敏原的潜在致敏性,也可能因聚集而使得过敏原表位被破坏或者掩盖进而降低致敏性。消化吸收性的改变也会影响蛋白的致敏性,通过加工若能增强过敏原蛋白的消化吸收性,其致敏性可能会降低,主要是由于消化过程中蛋白被分解为小的片段,过敏原表位被破坏,与抗体的结合能力下降;同时消化也可能暴露出过敏原中包埋的天然表位而增强致敏性。

蛋白质的结构决定其功能,但对于过敏原蛋白,其结构变化和功能(尤其是致敏性)变化之间的规律性联系还未被阐明,还需要大量的实验数据来支撑这一规律的探索。揭示加工中花生过敏原蛋白结构的变化与性质之间的规律,将有助于通过加工定向影响花生致敏性,实现低致敏甚至是脱敏花生的生产,降低和消除花生致敏的食品安全风险。

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Alteration in structure of peanut allergens caused by processing and its impact on properties

ZHAO Rui-fang1,2,WU Zhi-hua1,2,LIAN Jun1,2,ZHAN Shao-de1,2,WANG Juan3,YAO Zhi-wen4,CHEN Hong-bing1,2,YUAN Juan-li1,5,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.School of Journalism & Communication,Nanchang University,Nanchang 330031,China;4.Engineering Training Centre,Nanchang Hangkong University,Nanchang 330063,China;5.Institude of Pharmacology Teaching and Research Section,Nanchang University,Nanchang 330006,China)

Peanut is listed among eight major food allergens by Food and Agriculture Organization(FAO). More and more attention had been paid on peanut allergy for its severe allergenic reactions and broadly application. Presented work summarized the relationship between the alteration on structure and properties of peanut allergens after vary processing. Attempt was made to help finding the way changing the properties of allergens directionally by process.

peanut;allergen;structure;allergenicity

2015-06-23

赵瑞芳(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：食品安全，E-mail：loverainbowfang@163.com。

*通讯作者:袁娟丽(1976-)，女，博士，讲师，研究方向：营养与卫生学，E-mail：chinese582@sohu.com。

国家高技术研究发展计划(863计划)资助(2013AA102205)；江西省青年科学家(井冈之星)培养对象计划(20142BCB23007)。

TS252.7

A

1002-0306(2015)23-0386-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.072