白念珠菌CaFIG1基因缺失突变株的构建

王雅楠，王军军，徐大勇，蒋伶活

(江南大学生物工程学院国家工程实验室，江苏无锡 214122)



白念珠菌CaFIG1基因缺失突变株的构建

王雅楠，王军军，徐大勇，蒋伶活*

(江南大学生物工程学院国家工程实验室，江苏无锡 214122)

[目的]研究CaFIG1基因除参与有性生殖过程外，是否还参与细胞钙稳态等其他功能，对CaFIG1进行基因敲除。[方法]采用2种方法分别敲除CaFIG1的2个等位基因，一种通过PCR扩增HIS1敲除盒，另一种通过克隆的手段构建URA3敲除盒。[结果]从白念珠菌RM1000中成功敲除了CaFIG1双等位基因。[结论]该敲除策略同样适用于其他基因的敲除，提高了基因敲除的效率。

白念珠菌；CaFIG1；基因敲除

白念珠菌(Canidiaalbicans)是一种已知的条件致病菌，寄生于正常人体的皮肤粘膜，与其宿主免疫系统维持平衡的状态[1]。白念珠菌是研究真菌致病性的重要模式生物，具有广泛的科研应用价值。随着现代分子生物学技术的进步，白念珠菌的基因组测序工作已经完成，尤其白念珠菌菌丝遗传发育的机制已发展到全基因组水平。但白色念珠菌致病机理仍不完全清楚，因此，有必要从分子水平上对白念珠菌的基因功能进行深入研究，进一步研究白色念珠菌基因的表达、调控机制、发病机理及耐药性，这有助于发现新的抗真菌药物。

在真核生物细胞中，钙离子是最普遍且最重要的信号传导分子。钙离子不仅参与细胞内多种基础代谢反应，而且作为一种多功能的信号载体，调节细胞内各种生命活动[2-3]。细胞通过钙稳态系统调节胞内钙离子含量，使细胞质和细胞器中胞内钙离子浓度保持在稳定水平[4]。研究表明，钙离子信号传导对白念珠菌的侵染能力以及压力应答反应至关重要[5]。

白念珠菌质膜上亦存在2种钙吸收系统，包括高亲和性钙吸收系统(HACS，calcium-uptake system) 与低亲和性钙吸收系统(LACS，low-affinity calcium-uptake system)，两者共同控制胞外钙的内流，维持细胞钙稳态[6]。HACS由CaCch1-CaMid1-CaEcm7p 复合体组成。其中CaCch1p是HACS的催化亚基，CaMid1p为HACS的调节亚基，CaEcm7p为新发现的HACS的组成蛋白。LACS是另一种质膜钙转运系统，介导富钙条件下外钙内流[7]。CaFig1p是目前唯一已知的LACS 成分。关于CaFig1p功能研究，已有文献报道，在CIA4(ura3::λimm434/ura3::λimm434)背景下，CaFIG1基因的缺失能够显著抑制菌丝的重新定向以及交配保护下的细胞融合，但没有发现CaFig1p参与细胞正常生长的作用[8]。然而通过蛋白序列分析发现，CaFig1p在很多生物体内均存在同源蛋白，且这些蛋白都发挥着重要功能。如在酿酒酵母中，其同源蛋白ScFig1p蛋白具有促进钙内流的功能[9]；其在人体中也存在其同源蛋白PMP-22/EMP/MP20/Claudins，该蛋白与膜联蛋白的转运与组装有关[10]。因此笔者以RM1000为背景菌，采用2种敲除的手段构建CaFIG1单基因缺失株，旨在研究CaFIG1基因除参与有性生殖过程外，是否还具有其同源蛋白所发挥的功能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和引物。供试菌株和质粒见表1，引物见表2。

表1 试验所用菌株和质粒

注：未标于参考文献的均来源于该研究。

1.1.2 主要试剂。基因克隆相关的限制性内切酶、CIAP碱性磷酸酶、T4连接酶等购自宝生物大连有限责任公司；5-氟乳清酸(5-FOA)购自上海诺泰化工有限公司；转化相关的醋酸锂、聚乙二醇3350购自Sigma公司，ssDNA购自南京生兴生物技术有限公司；TaqDNA聚合酶和大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金公司；所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表2 试验所用引物

1.1.3 主要仪器。PCR反应仪(德国艾本德公司)、全温摇瓶柜(太仓强乐实验设备厂)、台式冷冻离心机(日本日立公司)、立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、凝胶成像系统(Bio-Rad公司)、数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)。

1.1.4 培养基。LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L(固体培养基加入琼脂粉20 g)。用1 mol/L NaOH溶液将其调pH至7.0，定容后121 ℃灭菌20 min。YPD培养基：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L(固体培养基加入琼脂粉20 g)，pH自然，121 ℃灭菌20 min。

SD-Ura培养基：酵母氮源1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，葡萄糖20 g/L，氨基酸mix 5.9 g/L，亮氨酸0.1 g/L，组氨酸0.02 g/L(固体培养基加入琼脂粉20 g)，pH自然，121 ℃灭菌20 min。

SD-His培养基：酵母氮源1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，葡萄糖20 g/L，氨基酸mix 5.9 g/L，亮氨酸0.1 g/L，尿嘧啶0.02 g/L(固体培养基加入琼脂粉20 g/L)，pH自然，121 ℃灭菌20 min。

SD-Ura-His培养基：酵母氮源1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，葡萄糖20 g/L，氨基酸mix 5.9 g/L，亮氨酸0.1 g/L(固体培养基加入琼脂粉20 g)，pH自然，121 ℃灭菌20 min。

5-氟乳清酸(5-FOA)固体培养基：称取0.1 g 5-FOA溶于提前预热的30 ml双蒸水中，过滤除菌后，加入到70 ml灭菌后未冷却的YPD固体培养基中。

1.2 方法

1.2.1 白色念珠菌基因组DNA的提取及鉴定。收集在SD-His或SD-Ura液体培养基中过夜培养的菌液1.5 ml，12 000 r/min离心1 min，收集白念珠菌细胞，提取白念珠菌DNA[13]。以白念珠菌基因组DNA为模板，分别用相应的引物检验CaFIG1基因的敲除。用FIG1-DF和 HIS1-DR及FIG1-DR和HIS1-DF这2对引物验证FIG1基因第一拷贝的敲除；用FIG1-ORF-UP和FIG1-ORF-DOWN，FIG1-DF和 HisG-DR及FIG1-DR和HisG-DF这3对引物验证FIG1基因第二拷贝的敲除。PCR产物经10 g/ml琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 质粒DNA的制备。将双酶切过的载体p5921和同源片段CaFIG1-L或同源片段CaFIG1-R按一定比例连接后转化至感受态大肠杆菌Trans1-T1，挑取克隆转化子接种于3 ml氨苄终浓度为50 ng/ml的LB+Amp液体培养基中，37 ℃，220 r/min恒温摇床振荡培养过夜。将过夜培养的菌液转移至1.5 ml EP管中10 000 r/min离心1 min，弃去上清。将菌体充分重悬于100 μl的碱I裂解液中。同时配制新鲜的碱Ⅱ裂解液(1 ml配方：880 μl ddH2O2，20 μl 10 mol/L NaOH，100 μl 10% SDS)，重悬充分后，加入200 μl的碱Ⅱ裂解，温和颠倒混匀5次，菌液变澄清。立即加入150 μl预冷的碱III裂解液，温和颠倒20次左右，有絮状沉淀产生。4 ℃下12 000 r/min离心10 min。用移液枪吸取400 μl的上清液至新的EP管中，同时加入400 μl酚/氯仿/异戊醇，充分振荡混合后，4 ℃，12 000 r/min离心10 min。EP管中菌液分层，将上清液移入新EP管中(注意不要吸到白色界面)，加入35 μl 3 mol/L NaAc，700 μl无水乙醇，颠倒混合后，-80 ℃放置20 min。12 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清液。加入500 μl 75%乙醇，洗涤沉淀，吸干残液，55 ℃干燥15 min左右至液体挥发完全。加入20 μl无菌水配制的200 μg/ml RNase水，55 ℃消化RNA 30 min。最后用琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA浓度。

2 结果与分析

2.1HIS1敲除盒的构建 以质粒pFA-HA-HIS1为模板，FIG1-HIS1-UP及FIG1-HIS1-DOWN为上下游引物，PCR扩增HIS1敲除盒。其理论条带大小应为1.8 kb。经过10 g/ml琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，PCR扩增获得片段和理论预计大小相符，说明经PCR扩增获得正确的CaFIG1基因敲除盒。

2.2URA3敲除盒的构建 采用克隆的手段构建URA3敲除盒。以质粒p5921为载体，将CaFIG1基因的同源片段L及R连接到载体质粒 p5921上hisG-URA3-hisG两侧相应酶切位点，构建了可以重复利用的敲除盒质粒pWC。构建示意见图2。

用引物FIG1-L-F和FIG1-L-R通过PCR扩增出带有SacI和KpnI 2个酶切位点的同源臂CaFIG1-L(图3A)。再用SacI/KpnI双酶切载体p5921及同源片段CaFIG1-L，运用胶回收试剂盒回收酶切产物后，将载体p5921和同源片段CaFIG1-L按照一定比例进行连接，并转化大肠杆菌感受态。对获得转化子提质粒后，用SacI/KpnI双酶切验证质粒p5921(作为负对照)及克隆转化子验证是否连接上同源片段CaFIG1-L。琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3B，将正确的转化子命名为pWC1。

在质粒pWC1的基础上用同样的方法连接同源片段CaFIG1-R，同理，用引物FIG1-R-F和引物FIG1-R-R通过PCR扩增出带有PstI，BamH I这2个酶切位点的同源臂CaFIG1-R(图3A)。用PstI和BamH I同时双酶切质粒pWC1及同源片段CaFIG1-R，酶切产物纯化后，将两者按照一定比例进行连接，并转化大肠杆菌感受态。对获得转化子提质粒后，用PstI/BamH I双酶切验证质粒p5921(作为负对照)及克隆转化子验证是否连接上同源片段CaFIG1-R。琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3C，将正确的转化子命名为pWC。

最后，用SacI/PstI线性化敲除盒质粒pWC，即获得了待转化用的URA3敲除盒。电泳检测结果见图3D。

2.3CaFIG1基因第一拷贝的敲除与鉴定 以实验室已有的野生型菌株RM1000为背景，敲除CaFIG1基因。用HIS1敲除组件敲除CaFIG1基因的第一拷贝。采用醋酸锂方法[14]，将4 ugCaFIG1基因敲除组件HIS1转化白念珠菌RM1000细胞，取适量转化菌液涂布于SD-His固体培养基上，30 ℃，培养2～3 d至单菌落出现。将获得的单菌落在SD-His固体培养基纯化后，接单菌落于3 ml SD-His液体培养基中30 ℃振荡培养过夜，收集细胞，提取基因组验证。以基因组为模板，用FIG1-DF和HIS1-DR及FIG1-DR和HIS1-DF这2对引物，退火温度均为53 ℃，延伸时间1.5 min，验证CaFIG1基因第一拷贝的敲除。正确敲除掉CaFIG1基因第一拷贝的菌株命名为WYCA-1，用10 g/ml琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图4。

2.4CaFIG1基因第二拷贝的敲除与鉴定 在敲除掉CaFIG1基因第一拷贝的基础上，用URA3敲除盒敲除CaFIG1基因的第二拷贝。采用醋酸锂方法[14]，将4 μgURA3敲除盒转化白念珠菌WYCA-1细胞，取适量转化菌液涂布于SD-Ura-His固体培养基上，30 ℃，培养2～3 d至单菌落出现。将获得的单菌落在SD-Ura-His固体培养基纯化后，接单菌落于3 ml SD-Ura-His液体培养基中30 ℃振荡培养过夜，收集细胞，提取基因组验证。以基因组为模板，首先用FIG1-ORF-UP和FIG1-ORF-DOWN验证CaFIG1基因的ORF是否还存在，在CaFIG1基因ORF不存在的基础上，用FIG1-DF和HisG-DR及FIG1-DR和HisG-DF这2对引物验证，退火温度均为53 ℃，延伸时间1.5 min。将正确敲除掉CaFIG1基因第二拷贝但带有Ura+标记的菌株命名为WYCA-2。PCR产物经10 g/ml琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5。

最后需要通过hisG片段重组去除URA3基因，选取WYCA-2菌株的转化子涂布于5-FOA平板上，培养3～5 d后长出单菌落。得到单菌落后，再挑取这些单菌落，分别划线于含有0.1%5-氟乳清酸的YPD平板及YPD平板上进行纯化，在30 ℃培养箱中培养2～3 d长出单菌落。能在YPD平板上生长但在含有0.1% 5-氟乳清酸的YPD平板上不生长的单菌落，可能利用了2个hisG片段的顺势重组除去了URA3基因。然后将其接种于YPD液体培养基中，过夜培养，提取基因组，进行PCR验证。以基因组为模板，FIG1-DF和 HisG-DR及FIG1-DR和HisG-DF这2对引物验证，退火温度均为53 ℃，延伸时间均为1.5 min。用10 g/ml琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图6。

3 结论与讨论

该研究采用2种不同的敲除策略，在RM1000背景下成功构建了白念珠菌CaFIG1双等位基因缺失株，为CaFIG1基因功能的研究奠定了基础。首先，以PCR为基础的基因敲除技术，构建HIS1敲除盒，敲除白念珠菌CaFIG1基因的一个拷贝。其次，通过克隆的手段，将CaFIG1基因的2个同源片段，分别连接到载体质粒 p5921的hisG-URA3-hisG两侧相应酶切位点，构建了可以重复利用的敲除盒质粒pWC。将其线性化后获得了URA3敲除盒，用于敲除CaFIG1基因的另一个拷贝。

与传统的基因敲除方法相比，使用2种不同的敲除策略，通过2个筛选标记，降低了在敲除基因第二拷贝时敲除盒替换第一拷贝的概率，实现目的基因的准确敲除。且依据基因的同源重组效率主要依赖于基因敲除组件提供的同源区域片段大小[15]，通过用长引物进行PCR扩增可以获得较长侧翼同源区域序列的敲除盒，有效地提高了同源重组的效率。这种基因敲除的策略为基因的敲除提供了一种新的思路与方法。

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Construction ofCaFIG1 Gene Deletion Mutant inCanidiaalbicans

WANG Ya-nan, WANG Jun-jun, XU Da-yong, JIANG Ling-huo*

(National Engineering Laboratory, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122)

[Objective] The aim was to constructCaFIG1 gene deletion mutant inCanidiaalbicanstostudythe additional functions ofCaFIG1 gene,such as participate in the regulation of cell calcium homeostasisits besides in mating. [Method] Two methods were adopted to knockout two alleles ofCaFIG1 gene. One wasHIS1 knockout cassette by PCR, the other wasURA3 knockout cassetteby clone. [Result] The study successfully knockout two alleles ofCaFIG1 gene inC.albicansstrains RM1000. [Conclusion] This knockout strategy was also applicable to knockoutother gene, and it would improve the efficiency of gene knockout.

Canidiaalbicans;CaFIG1; Knockout

国家自然科学基金项目(81371784)；江南大学自主研究计划重点项目(JUSRP51313B)。

王雅楠(1989-)，女，河南驻马店人，硕士研究生，研究方向：酵母遗传学与分子生物学。*通讯作者，教授，博士，博士生导师，从事酵母和丝状真菌遗传学与分子生物学研究。

2015-04-22

S 188

A

0517-6611(2015)17-043-04