外源一氧化氮对UV-B胁迫下红松幼苗光合特性和活性氧代谢的影响

魏晓雪，杨 臣，张文天，李德文

(1.黑龙江省科学院火山与矿泉研究所，黑龙江五大连池 164155；2.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040)



外源一氧化氮对UV-B胁迫下红松幼苗光合特性和活性氧代谢的影响

魏晓雪1，杨 臣1，张文天1，李德文2*

(1.黑龙江省科学院火山与矿泉研究所，黑龙江五大连池 164155；2.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040)

[目的]研究外源一氧化氮对增强UV-B辐射胁迫后红松幼苗光合特性和活性氧代谢的影响。[方法]设4个组：①CK；②SNP (0.01 mmol/L)；③UV-B (4.22 kJ/(m2·d))；④SNP(0.01 mmol/L)+ UV-B(4.22 kJ/(m2·d))。分别于处理1、3、5、7、9 d取样，测定各项生理指标。[结果] 施加外源NO，显著增加红松幼苗针叶光合色素含量，缓解UV-B对光合作用的破坏；外源NO处理降低UV-B胁迫对红松幼苗针叶细胞膜的膜相对透性的破坏及MDA含量的积累；UV-B处理和SNP+UV-B处理都提高了APX、SOD和POD活性。[结论]植物防卫反应信号分子NO广泛参与红松幼苗对UV-B胁迫的应答与防御。外源NO对红松幼苗由于UV-B辐射引起的氧化损伤有明显的缓解作用。

外源NO；UV-B胁迫；红松；生理指标

一氧化氮(Nitric oxide,NO)是一种广泛存在于生物体内的气体活性分子，也是一种活性氮(Reactive nitrogen species,RNS)。它在植物体内主要通过一氧化氮合成酶(NOS)和硝酸还原酶(NR)催化形成[1]。作为一种化学性质活跃的生物自由基，NO在植物生长发育、抗逆性等多种生命活动中充当第二信使[2]。来源于NOS系统的NO是UV辐射下产生的信号分子。UV辐射导致的植物生长受到抑制是通过影响细胞壁降解酶活性，改变细胞壁化学特性和机械延展性而实现的。作为UV辐射的第二信使NO介导了这一过程[3]。NO作为UV-B辐射产生的第二信使已成为现今植物逆境生理和信号转导领域的研究热点[4]。

Beligni等[5]研究表明，植物细胞内的NO具有双重生理效应，其中低浓度NO具有保护作用，而高浓度NO则具有生理毒性。前人研究证明，外源NO可减少胁迫条件下植物体内的活性氧积累，从而缓解干旱、低温等胁迫条件对植株造成的伤害[6-7]。段凯旋等[8]研究发现，适当浓度的外源NO可通过提高平邑甜茶根系和叶片的抗氧化酶活性，降低铜、镉胁迫下O2-·产生速率、MDA含量，从而起到保护幼苗的作用。付士磊等[4,9]分别研究了外源NO对干旱胁迫下杨树幼苗和核桃幼苗生理特性的影响。目前，关于外源NO提高植物抗逆性的报道主要集中于盐胁迫和干旱胁迫研究方面，且多集中于草本植物。关于木本植物的研究较少，迄今很少涉及外源NO对UV-B胁迫下红松幼苗生理作用的研究报道。

红松(Pinuskoraiensis)是整个北半球中高纬度地区分布面积最大的三大五针松之一，是目前世界上珍贵而稀有的多用途树种之一[10]。选择3年生人工种植的红松幼苗为材料，笔者研究了外源NO对UV-B胁迫下红松幼苗光合参数、叶绿素含量以及活性氧代谢系统的影响，为了解NO提高植物抗逆性的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计 试验于2011年1月3～10日在东北林业大学森林植物生态学重点实验室温室内进行。试验材料为3年龄红松幼苗，将幼苗随机分为4组，每组60株。供试土壤的基本理化性质为：pH 5.6，速效氮200 mg/kg，速效磷90 mg/kg，速效钾200 mg/kg，有机质2.5%。试验设4个处理：①CK；②SNP (0.01 mmol/L)；③UV-B (4.22 kJ/(m2·d))；④SNP(0.01 mmol/L)+ UV-B(4.22 kJ/(m2·d))。CK为温室内自然条件处理。UV-B处理组为在温室内自然光照基础上人工增加4.22 kJ/(m2·d)辐射强度的UV-B(280～320 nm)光照。UV-B辐射处理通过悬在植株上方的UV-B辐射灯管产生。处理时间为每天12 h(6:00～18:00)。UV-B辐射强度用光谱仪AvaSpec 2048-2进行测定。生物有效辐射用Caldwell[11]文献方法标定到300 nm植物响应作用光谱加权处理获得。用文献[12]模型，算得补增UV-B辐射的强度。

外源NO供体用硝普钠(SNP)制得。先配制1 mmol/L SNP母液，4 ℃保存，用时按试验所需的浓度进行稀释。CK和UV-B处理喷施清水，SNP处理用0.01 mmol/L SNP溶液100 ml均匀喷施于叶面。每个处理均随机取样，处理1、3、5、7、9 d后测定各项生理指标。

1.2 试验方法

1.2.1 Pn-PAR响应曲线的测定。选天气晴好的上午，用LI-6400便携式光合仪，在人工红蓝光源，气温(Tair) 24～27 ℃，相对湿度(RH) 50%～70%，CO2浓度为400 μmol/(m2·s)，光合有效辐射(PAR)强度分别设定为1 800、1 200、1 500、1 000、800、500、200、100、50、0 μmol/(m2·s)条件下，测定叶片净光合速率(Pn)。用光响应模型，拟合Pn-PAR响应曲线[13]。

1.2.2 光合色素含量的测定。光合色素含量参考前人方法[14-15]测定。取0.05 g红松针叶，剪碎，放入试管中，加入5 ml二甲基亚砜(DMSO)，黑暗下60 ℃水浴直至红松针叶完全变白，以DMSO为空白，使用紫外可见分光光度计分别测定提取液480、649、665 nm的吸光值。根据相关公式，分别计算叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素的含量，单位为mg/g FW。

1.2.3 过氧化氢(H2O2)自由基含量的测定。H2O2与硫酸钛(或氯化钛)生成过氧化物-钛复合物黄色沉淀，可被H2SO4溶解，在415 nm波长下采用比色法测定[16]。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量的测定。MDA含量参照高俊凤[17]的方法测定。

1.2.5 NO含量的测定。采用试剂盒法(试剂盒购自南京建成生物工程研究所)。取1 g针叶，加入40 mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.2)3 ml,研磨，2 ml冲洗，用2层纱布过滤后，在8 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清液,参考说明书进行测定。

1.2.6 抗氧化酶活性的测定。抗氧化酶活性的测定参考前人方法[18]。取0.5 g新鲜红松针叶，在液氮中充分研磨，迅速转入含有5 ml 50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0，含1 mmol/L EDTA和浓度1%PVP)的离心管中，10 000 r/min 4 ℃离心15 min，取上清液，弃沉淀，再10 000 r/min 4 ℃离心10 min，上清液即为粗酶液，4 ℃保存，备用。过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化物酶(POD)的活性分别以每分钟A240、A290和A470变化值表示；超氧化物歧化酶(SOD)活性以单位时间内抑制氮蓝四唑光化还原50%为一个酶活性单位(U)。

1.3 数据分析 用Excel 2003 软件进行数据处理。采用SPSS 13.0软件，进行方差分析及显著性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 Pn-PAR响应曲线 由图1可知，不同处理对红松幼苗针叶Pn-PAR响应曲线的影响不同。处理9 d后，在PAR到达500 μmol/(m2·s)以后,SNP+UV-B处理净光合速率显著高于其他3个处理。与CK相比，SNP处理和UV-B处理净光合速率数值差异不明显。

2.2 光合色素含量 由表1可知，处理9 d后，与CK相比，SNP处理增加了红松幼苗针叶中光合色素(叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素)的含量，而UV-B处理和SNP+UV-B处理则在0.05水平显著降低光合色素的含量。

表1 4个处理对红松幼苗针叶光合色素含量的影响 mg/g

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 H2O2含量 由图2可知，4个处理对红松幼苗针叶中H2O2含量的影响不同。处理9 d后，与CK相比，其余3个处理都在0.05水平显著提高H2O2含量。UV-B处理H2O2含量最高，达到300 μmol/g；SNP处理H2O2含量表现为升高趋势；SNP+UV-B处理H2O2含量变化规律不明显。

2.4 MDA含量 由图3可知，处理9 d后，与CK相比，其余3个处理红松幼苗针叶中MDA含量都在0.05水平显著增加。随着处理时间的延长，与CK相比，SNP处理MDA含量表现为先降低后升高的趋势，处理9 d后SNP处理MDA含量最高；SNP+UV-B处理下前2次取样MDA含量最高，而后含量降低，表现为先升高后降低的趋势；UV-B处理MDA含量呈现先升高再降低的趋势。

2.5 NO含量 由图4可知，处理9 d后，与CK相比，其余3个处理都提高红松幼苗针叶中NO含量，最大值出现在SNP+UV-B处理。随着处理时间的延长，不同处理对NO含量的变化各不相同。SNP和UV-B处理下NO含量呈现先升高后降低的趋势，除第1次取样外，NO含量都高于CK，NO含量最大值有2次都出现在UV-B处理，而SNP+UV-B处理对NO含量并无明显的影响。

2.6 抗氧化酶活性 由表2可知，处理9 d后，4个处理对红松幼苗针叶中抗氧化酶活性影响各不相同。与CK相比，SNP和UV-B处理在0.05水平显著降低CAT活性，SNP+UV-B处理则在0.05水平显著提高CAT活性；与CK相比，其余3个处理都在0.05水平显著提高APX和SOD活性，APX和SOD活性最大值出现在SNP+UV-B处理；与CK相比，SNP处理在0.05水平显著降低了POD活性。UV-B处理和SNP+UV-B处理则在0.05水平显著提高POD活性，SNP处理下POD活性最小，仅为3.09 U/(g·min)，UV-B处理下POD活性最大，高达74.78 U/(g·min)。

3 结论

(1)施加NO显著增加了红松幼苗针叶光合色素含量，表明外源NO有助于维持红松幼苗针叶的叶绿素含量，外源NO缓解了UV-B对光合作用的破坏作用。

(2)外源NO处理降低了UV-B胁迫下红松幼苗针叶细胞膜的膜相对透性、MDA的积累。外源NO处理引起UV-B胁迫下红松幼苗针叶H2O2含量与H2O2代谢酶活力的变化，共同保护红松幼苗不受过多活性氧的伤害，对UV-B胁迫导致的红松幼苗活性氧伤害具有保护作用。

(3)植物防卫反应信号分子NO参与红松幼苗对UV-B胁迫的应答与防御。NO作为UV-B辐射的第二信使介导紫外胁迫信号的转导过程，并诱发植物产生抗性反应。外源NO对UV-B辐射胁迫导致的红松幼苗伤害具有一定的缓解作用。

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The Effects of Exogenous Nitric Oxide on Photosynthetic Characteristics and Active Oxygen Metabolism inPinuskoraiensisSeedlings under UV-B Stress

WEI Xiao-xue1, YANG Chen1, ZHANG Wen-tian1, LI De-wen2*

(1. Institute of Volcanoes and Mineral Springs, Heilongjiang Academy of Science, Wudalianchi, Heilongjiang 164155; 2. Key Laboratory of Forest Plant Ecology, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

[Objective] To research the influence of photosynthetic characteristics and active oxygen metabolize ofPinuskoraiensisSieb. et Zucc. seedling what was in UV-B stress which had been enhanced by exogenous NO. [Method] Four groups in this experiment were set up: ① CK; ② SNP (0.01 mmol/L), ③ UV-B (4.22 kJ/(m2·d), ④ SNP (0.01 mmol/L)+UV-B(4.22 kJ/(m2·d).Then took samples from each group and measured physiological indexes when they had been disposed 1, 3, 5, 7, 9 days. [Result] Adding exogenous NO had not only significantly increased the photosynthetic pigment content ofPinuskoraiensisseedling needles but also reduced damage of UV-B to photosynthesis. Adding exogenous NO reduced damage of UV-B stress to the membrane relatively permeability ofPinuskoraiensisseedling needles cytomembrane and accumulation of MDA content. Not only UV-B-dispose but SNP+UV-B-dispose could raise activity of APX, SOD and POD. [Conclusion] As the plant defense reaction signal molecule, NO partook reply and defense ofPinuskoraiensisseedling to UV-B-dispose widely. Exogenous NO could relievePinuskoraiensisseedling oxidation harm from UV-B radiation evidently.

Exogenous nitric oxide; UV-B radiation;Pinuskoraiensis; Physiological indexes

中央高校基本科研业务费专项(2572015CA03)；黑龙江省科学院科学研究基金项目；中央高校基本科研业务费专项(2572014EA01-02)。

魏晓雪(1982-)，女，黑龙江兰西人，助理研究员，博士，从事植物生理生态方面的研究。*通讯作者，副教授，博士，从事植物生理生态方面的研究。

2015-04-20

S 791.247

A

0517-6611(2015)17-009-03