蚓激酶F-III-1基因植物表达载体的构建

陈臻毅，侯学文，苏志坚，邱道寿(1．广东省农业科学院作物研究所，广东省农作物遗传改良重点实验室，广东广州 510640;．华南农业大学生命科学学院，广东广州 510640;．暨南大学生命科学技术学院，广东广州 5106)

蚓激酶是具纤溶或溶栓活性的多酶组分，又称蚯蚓纤溶酶(Earthworm Fibrinolytic Enzymes，EFE)，是一类含多组分的纤维蛋白水解酶，广泛分布于多种蚯蚓的消化道内腔及体液中［1－2］。蚓激酶可以直接和间接水解纤维蛋白，具有溶解血栓和阻止血栓形成的功效;还可以将纤溶酶原激活并转化为纤溶酶，或刺激人血管内皮细胞释放组织纤溶酶原激活剂(t-PA)，从而能够间接溶解血栓［3］。鉴于蚓激酶具有这些功效作用，且副作用极小，因此被认作是一种比尿激酶、链激酶、t-PA等应用前景更好的溶栓药物。目前临床应用的蚓激酶都是从蚯蚓体内直接提取的，不仅制备工艺复杂，而且产量较低。近年来，利用基因工程手段重组表达蚓激酶成为当前热点，国内外已有许多专家试图通过基因工程技术将蚓激酶基因导入大肠杆菌［4］、酵母菌［5］、杆状病毒［6］、牛乳腺细胞［7］、山羊乳腺细胞［8］和植物［9－11］等，以期重组表达蚓激酶蛋白。笔者以经过植物密码子优化后的蚓激酶成熟肽F-III-1为目的基因，通过构建植物表达载体，为利用基因工程方法在植物中表达蚓激酶蛋白奠定基础。

1 材料与方法

1．1 试验材料 pCAMBIA3301载体、宿主菌E．coli TOP10为华南农业大学生命科学学院植物逆境生物学实验室保存;pBA002载体为华南农业大学解新明教授惠赠;蚓激酶基因的原始序列来自GenBank数据库的蚓激酶成熟肽F-III-1(AAA96503．1)，在保持其氨基酸序列不变的前提下，利用中山大学生命科学学院基因岛网站(http://life．sysu．edu．cn/genedao/genetown/service/DNA_synthesis_empty．php3)进行了烟草(Nicotiana tabacum)密码子偏好性优化，根据优化后的基因序列设计合成13条超长引物，通过重叠延伸PCR(overlap extension PCR)方法完成片段的合成;Ex Taq DNA聚合酶、KOD高保真酶、连接试剂盒购自大连宝生物技术公司;质粒小提试剂盒、琼脂糖回收试剂盒购自OMRGA公司;核酸分子量标准购自上海生工生物工程有限公司;限制性内切酶购自Biolabs公司;其他试剂均由国内相关厂家及公司生产;PCR引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成;DNA测序由中美泰和生物技术有限公司完成。

1．2 目的基因的亚克隆改造

1．2．1 引物设计。根据植物表达载体 pCAMBIA3301和pBA002多克隆位点的特性，以上述优化后的F-III-1基因序列为模板，设计5条PCR引物(表1)，通过PCR反应对F-III-1基因进行亚克隆改造。

表1 引物序列及酶切位点

1．2．2 PCR 反应。PCR 反应体系:反应总体积为 50 μl，其中上、下游引物各 2．5 μl，10 × KOD-Plus Neo buffer 5 μl，25 mmol/L MgSO43 μl，2．0 mmol/L dNTP 5 μl，F-III-1 基因片断(200 ng/μl)1 μl，KOD-Plus Neo 1 μl，用无菌双蒸水补齐至50 μl。反应条件:94℃预变性5 min;98℃变性10 s，58℃退火30 s，68℃延伸1 min，共28次循环;最后68℃延伸5 min，4℃保持。

1．2．3 F-III-1基因酶切位点的改造与His-tag的引入。根据上述PCR反应程序，以F-III-1基因为模板，用NLK-NcoI-1-F和NLK-PmlI-R作为上、下游引物，通过PCR扩增在F-III-1基因首尾引入NcoI、PmlI双酶切位点;以同样的方法，用NLK-XhoI-1-F、pMD18-T-BamHI-R为上、下游引物，通过PCR扩增在F-III-1基因首尾引入XhoI、BamHI双酶切位点;以NLK-NcoI-1-F、NLK-PmlI-717-R(His6)为上、下游引物，在 FIII-1基因末尾引入6xHis-tag，首尾引入NcoI、PmlI双酶切位点;以F-III-1(6xHis)基因为模板，用NLK-XhoI-1-F、pMD18-T-BamHI-R作为上、下游引物，在F-III-1(6xHis)基因首尾引入XhoI、BamHI双酶切位点(图1)。

1．2．4 PCR产物与pMD18-T-S载体的连接和测序。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收、纯化，用rTaq酶给目的片段加A尾巴，rTaq 的 10 μl反应体系:纯化的目的片段 8．5 μl，10 ×rTaq buffer 1 μl，rTaq 0．2 μl，用无菌双蒸水补足至 10 μl。然后用T4DNA连接酶与pMD18载体4℃连接过夜。将连接反应产物转化E．coli Top10感受态细胞，以菌落为模板，以pMD18载体通用引物进行PCR筛选阳性克隆。选取若干PCR呈阳性克隆于LB液体培养基中培养，抽提质粒，进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒送中美泰和生物有限公司测序，将测序验证正确的菌株于15%甘油中－70℃保存备用。

1．3 表达载体的构建及鉴定 用NcoI、PmlI双酶切pMD18-F-III-1重组质粒，试剂盒回收小片段，同时用NcoI、PmlI双酶切pCAMBIA3301质粒，试剂盒回收大片段。回收后的大、小片段用试剂盒进行连接。连接产物转化E．coli Top10感受态细胞。将转化后的大肠杆菌涂布在含有Kan抗性的LB平板培养基上培养，筛选阳性转化菌株。提取阳性转化菌株质粒，进行PCR和酶切鉴定。将鉴定正确的质粒送中美泰和生物有限公司测序验证。用同样方法NcoI、PmlI双酶切pMD18-F-III-1-6xHis)重组质粒，回收小片段，NcoI、PmlI双酶切pCAMBIA3301质粒，回收大片段，大、小片段连接。连接产物转化Top10，涂布Kan抗性LB平板，筛选阳性菌株，PCR和酶切鉴定，测序验证。

按照上述相同的方法，用XhoI与BamHI分别双酶切pMD18-F-III-1与pMD18-F-III-1-6xHis重组质粒，试剂盒回收小片段，同时用NcoI、PmlI双酶切pBA002质粒，试剂盒回收大片段。回收后的大、小片段分别用试剂盒进行连接。连接产物分别转化E．coli Top10感受态细菌，涂布含Spe(壮观霉素)抗性的LB平板培养基，培养、筛选阳性转化菌株。提取阳性转化菌株质粒进行PCR和酶切鉴定，将鉴定正确的质粒送中美泰和生物有限公司测序验证。

2 结果与分析

2．1 F-III-1基因的亚克隆 以烟草密码子偏好性优化后的F-III-1基因片段为模板，分别用NLK-NcoI-1-F和NLK-PmlIR、NLK-XhoI-1-F 和 pMD18-T-BamHI-R、NLK-NcoI-1-F 和NLK-PmlI-717-R(His6)等作为上、下游引物，通过高保真酶PCR扩增，在F-III-1基因首尾分别引入NcoI和PmlI、XhoI和BamHI、XhoI和BamHI等双酶切位点以及基因末尾引入6xHis-tag等亚克隆操作。首尾进行了双酶切位点改造的FIII-1基因(图2a)和末尾引入6xHis-tag的F-III-1基因(图2b)，其PCR扩增得到750 bp左右的单一条带，与预计片段717 bp和735 bp大小相近，经测序验证分别为所需目的片段(图2)。

2．2 表达载体的构建 用NcoI、PmlI双酶切pMD18-F-III-1重组质粒，1%琼脂糖电泳酶切产物，结果见图3。由图3可知，电泳图中可见2条带，一条为750 bp左右，应为目的片段F-III-1;另一条为2 700 bp左右，应为pMD18的骨架链(图3a)。同样，以NcoI、PmlI双酶切pCAMBIA3301质粒，电泳图中也可见2条带，一条为2 000 bp左右，应为GUS片段，另一条为9 000 bp左右，应是pCAMBIA3301的骨架链(图3b)。试剂盒回收750 bp左右的目的小片段和2 700 bp左右的pCAMBIA3301骨架大片段。回收后的大、小片段通过连接、转化和抗性筛选，获得重组质粒pCAMBIA3301-F-III-1阳性转化菌株。同法，获得重组质粒pCAMBIA3301-F-III-1-6xHis阳性转化菌株。

用NcoI、PmlI双酶切重组质粒pCAMBIA3301-F-III-1与pCAMBIA3301-F-III-1-6xHis，琼脂糖电泳酶切产物，分别可见2条电泳条带，一条为750 bp左右，分别为F-III-1与F-III-1-6xHis片段，另一条为9 200 bp左右，为pCAMBIA3301载体骨架(图4)。两阳性重组载体再送专业公司测序，得到了进一步验证。

用XhoI与BamHI分别双酶切pMD18-F-III-1与pMD18-F-III-1-6xHis重组质粒，回收小片段，同时用NcoI、PmlI双酶切pBA002质粒，回收大片段。回收后的大、小片段分别进行连接、转化、抗性筛选，分别获得重组质粒pBA002-F-III-1与pBA002-F-III-1-6xHis阳性转化菌株。将构建好的pBA002-F-III-1、pBA002-F-III-1-6xHis 表达载体分别用 XhoI、BamHI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳，可见2条条带，一条为750 bp左右，应为F-III-1或F-III-1-6xHis片段，另一条为10 000 bp，应为pBA002载体骨架(图5)。

将上述4个阳性重组载体送专业公司测序，进一步证实4个植物表达载体pCAMBIA3301-F-III-1、pCAMBIA3301-FIII-1-6xHis、pBA002-F-III-1 和 pBA002-F-III-1-6xHis得到成功构建，其构建流程图见图6。

3 小结与讨论

将外源目的基因有效导入植物基因组是植物分子生物学和遗传工程的一项基本技术［12］，目的基因的转化首先必须构建含有目的基因的植物表达载体，植物表达载体的构建是一个较复杂的过程，涉及到质粒提取、酶切、回收、连接、转化、筛选等过程［13］。构建表达载体一个非常关键的步骤是目的基因的亚克隆，通过设计引物、PCR扩增来改变目的基因两端的酶切位点是通常要应用的操作，在此过程中需要考虑到表达载体的酶切位点、保护碱基和起始密码子等，确保编码蛋白不会出现移码等问题。在目的片段和表达载体连接过程中，如果引物自身已足够长还要添加酶切位点和保护碱基时，可以考虑引入T-载体，T-载体可以将Taq，Tth，AmpliTaq直接相连。笔者在构建pCAMBIA3301-F-III-1-6xHis表达载体时，综合考虑到引物的特点，引入了T-载体，结果表明克隆效率非常高。

随着分子生物学的快速发展，植物遗传转化技术日趋完善，利用转基因植物生物反应器生产药用蛋白正成为当前该领域中研究最活跃、产业发展最迅速、效益最显著的热点之一。与微生物和动物生物反应器相比较，植物生物反应器具有生产成本低、遗传转化简单、后代遗传性状稳定、无毒副作用、安全性好、表达产物能进行正确修饰［14］等优势。因此，植物生物反应器被广泛使用于细胞素、激素、营养蛋白、单克隆抗体、酶、疫苗、各种生长因子及其他一些药物的原料生产［15］。烟草作为一种转基因模式植物，易于遗传转化获得稳定性状的转化植株，且种植面积大。自基因工程技术产生以来，利用烟草进行转基因研究成果很多，这是烟草得天独厚之处［16］。目前，人们对于烟草的遗传性状、外源基因的导入、基因整合和表达、转化细胞的培养、植株再生和优良株系选育等已经形成了较成熟的技术流程［17］。因此，该研究构建的4个植物表达载体为探讨蚓激酶在植物中的高效表达提供了技术平台。

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