大麦不同器官总RNA提取方法研究

郭 萍，李晓江，冯紫洲，德木齐格，王亚玲，杨 益，徐寿军*

(1.内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽 028042；2.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028042)



大麦不同器官总RNA提取方法研究

郭 萍1，李晓江2，冯紫洲1，德木齐格1，王亚玲1，杨 益1，徐寿军1*

(1.内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽 028042；2.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028042)

[目的] 探索出一套较好的大麦总RNA提取方法。[方法]以大麦的叶片、茎秆和子粒为试验材料，探索各器官总RNA提取方法。[结果]所得产物的检验结果表明，总RNA具有整齐且清晰的28S rRNA、18S rRNA条带，A260/A280均介于1.8～2.0。将提取的叶片总RNA反转录成cDNA，RT-PCR检测PCR产物在1 500 bp处。[结论]用此方法提取的大麦各器官总RNA质量较好，纯度较高，完整性较好，可用于进一步的分子生物学研究。

大麦；总RNA；提取

大麦(HordeumvulgareL.)属于禾本科小麦族大麦属普通大麦种，因营养价值高，兼有食用、饲用和酿造用等多种用途，在农业生产和国民经济发展中具有重要意义[1]。

从植物组织中提取纯度高和完整性好的RNA是进行Northern 杂交分析、建立cDNA 文库、RT-PCR、基因体外翻译、DDRT-PCR、cDNA 末端快速扩增及差异显示分析等分子生物学研究的重要前提。目前，提取植物RNA的方法有很多种，如Trizol 试剂快速提取法、CTAB法、热硼酸法及改良的热硼酸法、苯酚法、LiCl-尿素法及总RNA提取试剂盒等。但由于不同植物或同种植物不同组织所含成分不同，需要选择不同的方法，或者对一些方法进行调整和改进。运用上述方法，许多学者提取了水稻、小麦、玉米、大豆、高粱等植物的总RNA，为这些植物后续的分子生物学研究奠定基础。迄今为止，关于大麦各器官总RNA提取方法的研究较少。笔者以大麦的叶片、茎秆和子粒为试验材料，参照小麦多种总RNA的提取方法，探索出一套较好的大麦总RNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料。蒙啤麦1号，由内蒙古农牧业科学研究院提供，在大麦灌浆中后期分别取叶片、茎秆和子粒，保存于-80 ℃的冰箱中待用。

1.1.2 主要试剂。 RNAiso Plus、反转录试剂盒购自宝生物工程有限公司，DEPC处理水、水饱和酚、Agarose购自北京索莱宝科技有限公司，三氯甲烷(氯仿)、异丙醇、异戊醇、无水乙醇购自天津市东丽区天大化学试剂厂。

1.1.3 主要仪器。超低温冰箱、高压灭菌锅、烘箱、电子天平、超净工作台、快速混匀器、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外凝胶成像、紫外可见分光光度计、PCR仪。

1.1.4 试验用品的处理。将用于提取RNA的离心管、枪头等浸泡于0.1%DEPC溶液中12 h，121 ℃高压灭菌30 min，70～80 ℃烘干，备用。研钵用报纸包装，121 ℃高压灭菌30 min，160 ℃烘干，备用。用75%的乙醇擦拭超净工作台、离心机、离心管架、移液枪、试剂瓶等。

1.2 试验方法

1.2.1 叶片的提取方法。①取0.2 g叶片加入液氮研磨至粉末状移入1.5 ml离心管；②立即加入1 ml RNAiso plus试剂，使用快速混匀器剧烈振荡15 s，混匀样品；③将其水平静置5 min；④ 4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；⑤移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入0.2 ml氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡15 s，室温静置5 min；⑥4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑦移最上层水相到新的1.5 ml离心管中，加入0.25 ml NaAc和使其终浓度为10%的无水乙醇，盖紧管盖，轻轻混匀，室温静置10 min；⑧4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；⑨移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入1/5 体积的氯仿，剧烈振荡15 s，室温静置5 min；⑩4 ℃，12 000 r/min，离心10 min；取上清水相，加等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置10 min；4 ℃，12 000 r/min，离心10 min；弃上清，留沉淀，加入1 ml预冷的75%乙醇(用DEPC水配制)洗沉淀，轻轻混匀，4 ℃，12 000 r/min离心5 min；弃上清，待其干燥(5～10 min)，用适量DEPC水溶解沉淀，保存于-80 ℃的冰箱。

1.2.2 茎秆的提取方法。①取0.2 g茎加入液氮研磨至粉末状移入1.5 ml离心管；②立即加入1 ml RNAiso plus试剂，使用快速混匀器剧烈振荡15 s，混匀样品；③将其水平静置5 min；④4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；⑤移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入0.2 ml配好的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇中(V/V/V=25∶24∶1)，盖紧管盖，剧烈振荡15 s，室温静置5 min；⑥4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑦移最上层水相到新的1.5 ml离心管中，移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入1/5 上清液体积的氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡15 s，室温静置5 min；⑧4 ℃，12 000 r/min，离心10 min；⑨移最上层水相到新的1.5 ml离心管中，加入使其终浓度为10%的无水乙醇，盖紧管盖，轻轻混匀，室温静置10 min；⑩4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；取上清水相，加等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置10 min；4 ℃，12 000 r/min，离心10 min；弃上清，留沉淀，加入1 ml预冷的75%乙醇(用DEPC水配制)洗沉淀，轻轻混匀，4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；弃上清，待其干燥(5～10 min)，用适量DEPC水溶解沉淀，保存于-80 ℃的冰箱。

1.2.3 子粒的提取方法。①取0.2 g子粒加入液氮研磨至粉末状移入1.5 ml离心管；②立即加入1 ml RNAiso plus试剂，0.1 ml巯基乙醇，使用快速混匀器剧烈振荡15 s，混匀样品；③将其水平静置10 min；④4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑤移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入等体积配好的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(V∶V∶V=25∶24∶1)，盖紧管盖，剧烈振荡15 s，室温静置10 min；⑥4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑦移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入1/20体积上清液的4 mol/L KAc(pH 5.5)，加入1/10体积上清液的预冷无水乙醇，混匀，再加入等体积配好的氯仿∶异戊醇(V∶V=24∶1)，剧烈振荡15 s，室温静置10 min；⑧4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑨取上清加2倍体积预冷无水乙醇，轻轻混匀；⑩-20 ℃放置1 h；4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；弃上清，留沉淀，加入1 ml预冷的75%乙醇(用DEPC水配制)洗沉淀，轻轻混匀，4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；重复的操作；弃上清，待其干燥(5～10 min)，用适量DEPC水溶解沉淀，保存于-80 ℃的冰箱。

1.3 RNA检测

1.3.1 质量检测。用紫外分光光度计检测纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

1.3.2 完整性检测。用TaKaRa公司的RR047A反转录试剂盒，取2 μl叶片总RNA为模板，反转录体系参照说明书进行。利用DMGP引物进行PCR扩增试验，第一次PCR反应体系(25 μl)中包括 2.5 μl cDNA，2.5 μl 1×ExTaqbuffer，2 μl dNTP，0.5 μl GSR，0.5 μl GSF，0.25 μl ExTaq，16.75 μl ddH2O。第二次PCR反应体系是取2.5 μl第一次反应产物，加入试剂同第一次反应体系。2次反应程序相同：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃延伸40 s，72 ℃退火90 s ，25个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存，如需长期保存，应于-20 ℃或更低温度保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2 结果与分析

2.1 质量检测 经紫外可见分光光度检测，所提叶片、茎秆、子粒RNA的A260/A280分别为1.98、1.95、1.88，在1.8～2.0，表明RNA的纯度较高，能够达到分子生物学试验的要求。

琼脂糖凝胶电泳结果见图1～3。利用此方法提取的总RNA 可见清晰3条带，从上至下分别是28S、18S 及5S。

但所提总RNA有轻微拖尾、弥散和降解现象，可能原因有：①来自未处理干净的超净工作台、研钵、试剂瓶、离心管和电泳槽的RNase污染；②在接触没有经过处理的物品后，手套可能会沾染上RNase，若未经常换新手套，RNase很容易进入离心管，使RNA降解；③提取步骤多且时间过长，会影响提取RNA的回收率和质量。此外，子粒总RNA用DEPC水溶解时有不溶性的胶状物存在，可能是因为大麦子粒含有的酚类化合物被氧化后与RNA不可逆地结合，形成不溶性复合物[2]，也可能是未除尽的多糖形成难溶的胶状物，与不溶性复合物[2]，也可能是未除尽的多糖形成难溶的胶状物，与RNA共同沉淀下来[3]。因此，提取子粒的方法仍有待于进一步优化。

2.2 完整性检测 图4表明能成功地扩增出目的片段，说明提取的RNA样品质量好，可以进一步用于后续试验。

3 讨论

研究表明，来源于不同基因型植株同一种植物的同一种

组织材料，其RNA提取方法也可能不同[4]。该试验结果说明提取大麦叶片、茎秆、子粒总RNA的3种方法较好，适用于蒙啤麦1号的RNA提取，为提取其他品种大麦的RNA奠定良好的基础。影响总RNA提取质量的因素是多方面的，如组织的破碎程度，RNase的活性，多糖和蛋白质等大分子物质的存在[5]，操作中避免上述因素较难做到，因此提取较高质量总RNA一直是分子生物学研究的基础与重点。该试验提取的RNA质量有待于提高，试验方法仍有不足，需要进一步优化。由于该试验所用大麦材料均为保存在-80 ℃且是灌浆中后期的材料，若是幼嫩或新鲜材料提取效果会更好。

[1] 卢良恕.中国大麦学[M].北京：中国农业出版社，1995：339-361.

[2] GRAHAM G C.A method for extraction of total RNA from Pinus radiata and other conifers[J].Plant Mol Biol Reptr，1993，11：32-37.

[3] LEWINSOHN E，STEELE C L，CROTEAU R.Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms[J].Plant Mol Biol Reptr，1994，12：20-25.

[4] SU X，GIBOR A.A method for RNA isolation from marine macroalgae[J]. Anal Biochem，1988，174：650-657.

[5] 李宏，王新力.植物组织RNA提取的难点及对策[J].生物技术通报，1999，15(1)：36-39.

Study on the Total RNA Extraction Methods for Different Organs of Barley

GUO Ping1, LI Xiao-jiang2, FENG Zi-zhou1et al

(1.College of Agriculture，Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao, Inner Mongolia 028042;2.College of Life Science, Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao, Inner Mongolia 028042)

[Objective] The aim was to explore total RNA extraction methods for different organs of barley. [Method] Using barley leaves, stems and grains as the experimental materials , the total RNA extraction method of these organs were explored. [Result]The detected results of these products showed that the total RNA had clear and neat stripes of 28S rRNA and 18S rRNA in the RNA electrophoresis. The ratios ofA260/A280were between 1.8 to 2.0. Leaves total RNA isolated by these methods were reverse transcribed and high quality cDNA were obtained. RT-PCR detected the product of PCR was in the 1 500 bp.[Conclusion]These results showed that the quality of the extracted barley total RNA were good, high purity, good integrity, and were suitable for further research in molecular biology.

Barley; Total RNA; Extraction

国家自然科学基金项目(30360307)。

郭萍(1990- )，女，黑龙江鸡西人，硕士研究生，研究方向：大麦栽培生理。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事大麦栽培生理研究。

2015-04-24

S 188

A

0517-6611(2015)17-033-02