HPLC- UV 法测定薏苡仁指标性成分甘油三油酸酯含量*

鲁雅雯，王 鑫，蔡明宸，梅晓丹，张 锐，朱 江，邓仕任

（辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连116600）

薏苡仁为禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.Var.ma-yuen（Roman.）Stapf 的干燥成熟种仁,研究表明，薏苡仁油具有抗肿瘤和调整机体免疫功能的作用，其抗肿瘤的活性成分为甘油三酯类组分（TAGs）[1-3]，其中包括甘油三油酸酯，甘油三亚油酸酯等[4]。

目前，对于油脂的成分分析和质量控制，一般是先将油脂皂化水解成相应的脂肪酸后，再进行检测，但这种方法存在前处理复杂，衍生化不完全等弊端。目前，已有少数中药材油脂提取物（如薏苡仁油脂）开始采用HPLC 法对TAGs 进行直接测定，该方法无需水解等操作，因此具有操作简单，结果准确等特点。在2010 版中国药典所收载的薏苡仁油脂的TAGs 检测方法中，采用了HPLC 搭配蒸发光散射检测器（ELSD）对其进行含量检测[1,5]。，但由于采用了ELSD 进行检测，因而该方法使用成本较高，普及率较低，一定程度上限制了其广泛应用。基于上述考虑，我们建立了一种基于Uv 检测器的薏苡仁中甘油三油酸酯含量检测方法，与ELSD 法相比，Uv 法具有使用简便、普及率高等特点。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

日本岛津LC-10AT 型双泵高效液相色谱仪；SPD-10AVP 紫外检测器；METTLERAE240 型十万分之一分析天平（瑞士METTLER）；FA1004B 电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；KQ-250DB 型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；FW-100 型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）。

甘油三油酸酯对照品购自美国NU-CHEK 公司（批号：T-235-JA7-X，纯度＞99%）；乙腈、正己烷、异丙醇（A.R 天津科密欧化学试剂有限公司），其他试剂均为分析纯。

薏苡仁药材购自全国4 个产地共4 批，由辽宁中医药大学药学院初正云教授鉴定为禾本科植物薏 苡Coix lacryma -jobi L. Var.ma-yuen（Roman.）Stapf 的干燥成熟种仁。

1.2 色谱条件

色谱柱：MicrosorbC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈- 异丙醇（60∶40）；流速：1mL·min-1，检测波长：205nm，柱温：20℃。理论塔板数按甘油三油酸酯计算应不低于9000。

1.3 对照品溶液的制备

精密称取甘油三油酸酯对照品适量，加乙腈-异丙醇- 正己烷（2∶2∶1）制成1mL 含3.0mg 的溶液，用微孔滤膜（0.45um）滤过，取续滤液，即得。

1.4 供试品溶液的制备

取薏苡仁粉末（过三号筛）10g，加入石油醚50-70mL，浸泡2h，超声处理（功率80W,频率40kHz）40min，滤过，滤液置坩埚内水浴挥干溶剂，取出，放冷，称重，精密称取300.0mg 薏苡仁油于10mL 容量瓶中，用溶剂异丙醇- 乙腈- 正丁醇（2∶2∶1）定容，摇匀，用微孔滤膜（0.45um）滤过，取续滤液，即得。

1.5 线性范围的考察

分别精密量取甘油三油酸酯对照品溶液（2.999mg·mL-1）2.0；5.0；10.0；15.0；20.0uL 注入液相色谱仪，在上述条件色谱下测定峰面积，以进样量（μg）的（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，作标准曲线，甘油三油酸酯的回归为:Y=1.5×105X+81199，相关系数r=0.9993（n=5）,线性范围为5.998～59.98μg。

1.6 精密度试验

取同一份薏苡仁供试品溶液重复进样6 次，以峰面积计算，甘油三油酸酯含量的精密度RSD为1.02%。

1.7 重复性实验

取同一批薏苡仁药材样品6 份，按1.4 项下方法平行制备供试品溶液并测定,在1.2 项色谱条件下测定，按甘油三油酸酯峰面积计算，RSD=1.054%，表明本方法重复性符合分析要求。

1.8 稳定性实验

取薏苡仁供试品溶液在0，2，4，6，8，12，24，48h分别进样测定,以峰面积计算，考察其48h 内稳定性。结果甘油三油酸酯RSD=1.105%,表明样品溶液在48h 稳定。

1.9 加样回收率实验

精密称取已知含量薏苡仁样品9 份，3 份为一组，精密加入低、中、高浓度甘油三油酸酯对照品适量，按1.4 项下供试品溶液的制备方法制备，测定峰面积以计算含量、回收率，结果平均加样回收率100.4%，RSD=1.31%（n=9）。

1.10 样品的含量测定

分别取不同产地的薏苡仁药材粉末（过3 号筛）各10g，精密称定，按1.4 项下制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，采用外标法以峰面积计算甘油三酯的含量。其色谱图见图1，结果见表1。

图1 甘油三油酸酯对照品（上）及薏苡仁药材（下）HPLC 图谱Fig.1 HPLC of reference substance and sample of Coix seed

表1 薏苡仁中甘油三油酸酯的含量测定结果Tab.1 Determination result of triacylglycerolscontent in Coix seed

2 结果与讨论

2.1 检测器及检测波长的选择

紫外吸收检测器不仅灵敏度高、噪音低、线性范围宽、有较好的选择性，而且对环境温度、流动相组成变化和流速波动不太敏感，因此，既可用于等度洗脱，也可用于梯度洗脱。由于灵敏高，因此即使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用UV 检测器进行微量分析。由于甘油三油酸酯无长共轭基团，特征吸收值较低，故选择205nm 作为检测波长。

2.2 流动相的选择

经查阅文献，分离甘油三酯类成分现常采用非水反相色谱模式,经比较了纯乙腈、乙腈- 正丁醇（70∶30；V∶V）、乙腈- 甲醇（70∶30；V∶V）、乙腈-水（70∶30；V∶V）和乙腈- 异丙醇（70∶30；V∶V）等不同溶剂做流动相的分离效果，其中以乙腈- 异丙醇（70：30；V∶V）分离效果最好，故选择乙腈- 异丙醇做流动相；当乙腈- 异丙醇比例为（70∶30；V∶V），流速为1mL·min-1时，样品各组分分离效果较好，分离度较高，但出峰时间过长；流动相比例调整为（55∶45）流速1mL·min-1时，样品各组分分离效果不好，分离度较低。综合考虑出峰时间和分离效果等因素，调整流动相比例为乙腈- 异丙醇（60∶40；V∶V）、流速1mL·min-1时取得了较好的分离效果。

2.3 柱温的选择

本实验分析的样品为油脂类物质，温度对其影响较大，故考察不同温度时样品的分离度30℃时扩散现象严重，10℃时出峰时间较长，综合考虑分离度和出峰时间故选用20℃。

2.4 提取方法及提油率

文献表明，对于种子类药材的提取以回流提取，索式提取，超声提取方法等最为常用，提取溶剂以乙酸乙酯、石油醚等最为常用。实验采用正交实验多次考察，最终确定提取方案为石油醚50～70mL，浸泡2h，超声处理（功率80W，频率40kHz）40min。经此方法测得来自宁化、贵州、福建、云南的药材平均含油量分别为6.99%、6.42%、6.62%、6.68%，以此数据进行最终甘油三酯的计算。

2.5 含量测定

采用HPLC-UV 法有效地解决了薏苡仁油中甘油三酯的定性、定量分析，为薏苡仁及其油酯的分析提供了依据。含量测定结果表明四批样品均高于2010 版中国药典HPLC-ELSD 测定薏苡仁中甘油三油酸酯规定的含测范围的规定，表明四批样品质量均上乘，且含量测定结果显示不同种源的薏苡仁中甘油三油酸酯含量有一些差异，来自贵州产地和福建宁化的薏苡仁药材样品的含量高于其他产地的，结果与任江剑等含测结果一致[6]，说明由于各地种植方法和气候条件的影响，形成了包括薏苡仁中化学成分的含量差异。

［1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M].北京：化学工业出版社，2010,353.

［2] 李炳生,陈秀华,任文龙.康莱特注射液的抗肿瘤作用［J].中国医药工业杂志,1998,29（10）:456.

［3] 陆蕴,张仲苗,章荣华.薏苡仁油抗肿瘤作用研究［J].中药药理与临床,1999.

［4] 李大鹏,黄洁敏,苏维埃,等.薏苡仁油脂的化学成分分析［J].中药新药与临床药理,1999,2（10）:99.

［5] 肖小年,薄春燕,易醒,胡少华,熊华.薏苡仁油中甘油三酯含量的快速测定［J].时珍国医国药,2011,22（4）:877-878.

［6] 任江剑，俞旭平，张斌，王志安.不同种源薏苡仁中甘油三油酸酯含量比较［J].中国现代中药,2011,13（4）:15-17.