动物源性葡萄球菌多重耐药基因cfr研究进展

保　雨，刘亚娟，刘　力＊，彭祥伟，张昌莲（.西南大学动物科技学院，重庆40075；.重庆市畜牧科学院家禽研究所，重庆40005）



动物源性葡萄球菌多重耐药基因cfr研究进展

保雨1，刘亚娟1，刘力1＊，彭祥伟2，张昌莲2
（1.西南大学动物科技学院，重庆400715；2.重庆市畜牧科学院家禽研究所，重庆400015）

摘 要：葡萄球菌是畜禽化脓性感染、败血症或脓毒败血症的主要病原体，常引起奶牛乳腺炎、禽类葡萄球菌病、羔蜱脓毒症等疾病。由于抗生素的滥用，出现了大量耐药性葡萄球菌，其中携带多重耐药基因cfr的葡萄球菌广泛存在于在畜牧生产中。该类葡萄球菌通过cfr的编码产物作用于核糖体23SrRNA腺苷2503的C8位点，对氯霉素类、林可酰胺类、恶唑烷酮类、截短侧耳素类和链阳菌素A类耐药，为动物疫病防控带来了巨大挑战。论文综述了动物源性葡萄球菌中cfr的分布情况、耐药机制、基因环境及检测技术等方面的研究进展，为深入研究其传播机制、研发新型抗葡萄球菌药物及建立切实有效的cfr多抗预测预警体系提供参考。

关键词：葡萄球菌；cfr；耐药机制；基因环境；检测技术

葡萄球菌（Staphylococcus）作为化脓性感染、败血症或脓毒性败血症的主要病原体，常造成奶牛乳腺炎、禽葡萄球菌病、蜱脓毒血症等化脓性或毒素性疾病，降低动物生产力，造成巨大的经济损失，严重影响畜牧业的发展。近年来，由于畜牧业发展的集约化和规模化，抗生素做为治疗用药和添加剂大剂量、无限制的使用，造成大量耐药病菌的出现，为临床用药带来了极大的困难，同时其在动物产品中的残留也造成了严重的公共卫生问题。细菌耐药性包括固有耐药和获得性耐药，抗生素诱导产生的耐药称为获得性耐药。耐药菌株大多依赖耐药基因的编码产物介导耐药。动物源性葡萄球菌普遍含有耐药基因。迄今为止，已经在动物源性葡萄球菌中发现了40多种耐药基因［1］。chloramphenicol-florfenicol resistance（cfr）基因是唯一一种介导五类抗生素耐药的甲基转移酶基因，该基因通过编码甲基转移酶而对氯霉素类、林可酰胺类、恶唑烷酮类、截短侧耳素类、链阳菌素A类五大类抗生素（PhLOPSA）表现多重耐药，并对16种大环内酯类敏感性降低［2］。多重耐药基因cfr存在于多种耐药菌株中，除葡萄球菌、芽孢杆菌、肠球菌、巨型球菌、Jetgalic球菌等革兰阳性菌外，也存在于少数革兰阴性菌中。动物源性葡萄球菌是cfr基因的主要携带者，包括甲氧西林敏感金色葡萄球菌（MSSA）、甲氧西林耐药金色葡萄球菌（MRSA）、凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）、凝固酶变量猪葡萄球菌。

1　cfr阳性葡萄球菌的分布

细菌多重耐药是全球普遍存在的问题。1997年，德国Schwarz S教授首次从患呼吸道疾病的小牛鼻腔中分离得到一株对四环素、红霉素、卡那霉素、氯霉素和氟苯尼考低敏感的松鼠葡萄球菌，质粒分析发现pSCFS1含有cfr、ermC、spc和lsa（B）耐药基因［3］。cfr基因的发现使其成为国内外研究的热点。目前，国外已对cfr阳性菌株的流行分布进行大量的调查研究，研究发现cfr阳性葡萄球菌存在于德国、丹麦、美国、西班牙、意大利、哥伦比亚等多个国家［4-6］。我国复杂的用药环境及不完善的监测系统为cfr阳性菌株的大量出现提供了可能。近年来，在山东、北京、青岛、广州等多个不同地区发现了动物源性cfr阳性葡萄球菌菌株。张万江对山东3个规模化养猪场进行调查，发现33株cfr阳性的氟苯尼考低敏感葡萄球菌菌株［7］。2010年，王秀梅首次从患乳房炎的奶牛上分离得到一株携带cfr基因的ST9型MRSA株［8］，打破了仅在猪源性MRSA株中发现cfr基因的历史。2012年，王洋等［9-10］对采自31个不同农场和2个不同屠宰场的鸡、鸭、猪进行调查分析，发现21株携带cfr基因的凝固酶阴性葡萄球菌。由此可见，cfr阳性葡萄球菌菌株具有低宿主特异性，该菌株广泛存在于猪、牛、鸡、鸭等多种动物中。低宿主特异性一定程度上增加了监测难度。

cfr阳性葡萄球菌广泛存在于不同宿主体内，人源性cfr阳性葡萄球菌的发现使得多重耐药问题更加严峻。2007年，首次从哥伦比亚医院分离得到人源性cfr阳性MRSA株CM05［11］，随后在美国、意大利、西班牙、伊朗、墨西哥等地均发现人源性cfr阳性菌株［12-13］。国内也报道了重症监护病人感染的耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌携带cfr基因［14-15］。另外，首次对广州地区118份零售猪肉和鸡肉含有的葡萄球菌进行研究发现，其中22份零售肉中含有cfr阳性葡萄球菌［16］。从公共卫生的角度出发，食源性葡萄球菌中发现cfr基因，增加了其通过食物链转移至人类的可能，国内应加强对动物性食品中cfr阳性菌株的监测，防止cfr基因的水平转移。

2　Cfr蛋白的耐药机制

细菌耐药性的产生具有多种不同的方式。例如，细菌自身含有耐药基因，编码蛋白破坏抗生素的作用，从而产生耐药性；细菌本身具有多种耐药性外排泵或转运因子，将抗生素排出胞外；细菌细胞膜产生非渗透性；抗生素结合位点构型的改变；生成钝化酶，对抗生素进行共价修饰使其失去活性；分泌灭活酶，降解抗生素等。cfr基因是一种存在于多种细菌中的多重耐药基因，其编码包含349个氨基酸的rRNA甲基化转移酶，通过甲基化作用于核糖体23SrRNA的腺苷2503的C8位点介导耐药［17］。Cfr属于S-腺苷甲硫氨酸酶（SAM）超家族成员，该家族根据基本结构可分为3个亚家族，其中Cfr与RlmN属于A亚家族，其特殊的结构为甲基化过程提供必需的5'-脱氧核糖核苷和甲基基团［18］。

PhLOPSA五类抗生素主要通过阻止氨酰基tRNA分子结合到核糖体50S亚基的肽基转移酶中心（PTC）来抑制细菌蛋白的合成进而起到杀菌作用，PTC的主要结构为23SrRNA的V区，而Cfr正是作用于23SrRNA。经过药物足迹和飞行时间质谱分析发现，对于氯霉素和林可酰胺类药物，其作用位点与Cfr蛋白的作用位点存在部分重叠，Cfr蛋白使A2503甲基化的同时抑制C2498位的甲基化，甲基化后使得核糖体发挥正常的生理功能，从而表现出对氯霉素类和林可酰胺类耐药；大环内脂类抗生素的作用机制与林可酰胺类非常相似，推测大环内酯类的耐药机理与林可酰胺类相似；在空间结构上，革兰阳性菌的PTC 与A2503位相近，而恶唑烷酮类、截短侧耳素类和链阳菌素A类的作用位点为该中心，A2503位点的甲基化又抑制了这类抗生素对转肽中心的作用，从而表现耐药［19］。

3　cfr基因环境的研究

基因环境指耐药性基因周围的条件，包括耐药性基因定位及周围的其他基因或插入元件等。复杂的基因环境有利于耐药性基因的转移传播。cfr基因是目前发现的第一种介导恶唑烷酮类耐药的可转移基因，该基因的可转移性取决于可移动质粒及移动元件的存在。

cfr基因绝大多数由大小不同的可移动质粒携带，少数直接位于染色体上。现在，主要从猪源和牛源性凝固酶阴性葡萄球菌中分离得到7种含有cfr的质粒，分别是pSCFS1（17.1kb）、pSCFS3（35.7kb）、pSCFS6（43kb）、pBS-01（16.4kb）、pSS-01（40.0kb）、pSS-02（35.4kb）和pSS-03（7.1kb）［2］，而仅只有少数定位于染色体上。不同宿主或不同细菌体内发现相同的携带cfr基因的质粒，推测cfr基因可通过质粒在不同细菌及宿主间转移传播。

通常情况下，耐药菌通过整合单个耐药基因而表现多重耐药。cfr基因常与其他耐药基因或移动元件同时存在于质粒或染色体上。在pSCFS1上，除cfr基因外，还存在介导大环内酯类•林可胺类•链阳菌素类抗生素（MLSB）耐药的rRNA甲基化酶基因erm （33），介导大观霉素耐药的氨基环醇磷酸转移酶基因spc，介导林可霉素类耐药的新型ABC转运蛋白基因lsa（B）；在pSCFS3上，cfr位于转座子Tn558中，同时携带fexA基因和一段类似IS21-558的插入序列［3，20］；而pSCFS6由2个IS21-558序列、cfr和lsa（B）基因构成。在pSCFS3、pSCFS6和pSS-02质粒上，均含有插入序列IS21-558，而其他质粒均含有类似的插入片段。何涛等［10］对中国地区分离得到的21株动物源性cfr阳性耐甲氧西林葡萄球菌进行了基因环境研究，将携带cfr的质粒分为13种。在这些质粒中，包含了插入序列（IS21-558、IS256、IS257及IS1216E）和其他耐药基因（aacA-aphD、aadD、ble、fosD、erm（B）、erm（C）和fexA）。由此可见，插入序列IS21-558或类似的片段普遍存在于含cfr基因的质粒或染色体上，该片段对于cfr基因的水平传播具有重要意义。然而，对芽孢杆菌和肠球菌进行基因环境分析发现均没有IS21-558插入序列，推测IS21-558只在葡萄球菌的移动中起作用［21］。张万江对山东猪场获得的33株cfr阳性葡萄球菌进行基因环境研究发现，其中18株菌株的cfr定位于质粒上，大多cfr基因位于转座子Tn558中或附近，表明Tn558存在有利于cfr的转移传播［7］。目前的研究表明，cfr基因可进行水平、垂直转移，其中插入序列IS21-558、转座子Tn558、整合子具有重要作用，但对其具体的传播机制尚不清楚，有待进一步研究。

4　多重耐药基因cfr的检测

药敏试验是筛查细菌耐药性的金标准，主要包括纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、抗生素浓度梯度法（E-test）等。传统的药敏试验结合分子生物学技术可准确分析耐药基因。多重耐药基因cfr的检测技术主要有两种，药敏试验结合PCR技术、环介导等温扩增技术（LAMP）。药敏试验结合PCR扩增目前应用最多［22-23］。通常，研究人员通过药敏试验对细菌进行耐药性筛查，筛选出的耐药菌再进行PCR扩增及序列比对确定耐药基因。虽然药敏试验结合PCR扩增保证检测结果的准确性，但该方法仍存在耗时、易污染等缺点，不利于cfr基因的大规模快速筛查。环介导等温扩增技术（LAMP）是一种新型的恒温核酸扩增方法，可在等温条件下短时间进行核酸扩增，该技术广泛应用于耐药基因的检测。齐静等［24-25］利用3对引物在63℃等温条件下，经过35min的扩增有效的识别了cfr基因上的7个不同序列，实现cfr基因的快速检测。该检测方法的灵敏度高于常规PCR，试验中其对鸡葡萄球菌的检出限低至1pg DNA/管。同时，根据该方法组装相应的试剂盒为cfr基因的快速筛选提供了有利保障。LAMP技术对于多重耐药性基因cfr的检测是一项简单、快速、准确、灵敏的技术，尤其适用于大批量的实地检测，但此技术还有待于推广应用。

5　cfr基因的研究展望

cfr基因作为一种动物源性和人源性葡萄球菌共有的多重耐药基因，研究其耐药机制、传播机制、检测技术等具有非常重要的公共卫生学意义。目前，cfr在不同细菌间是如何进行传播的？它是否会通过食物链传递至人体？如何有效治疗和防控cfr阳性葡萄球菌感染引起的疾病等一系列的问题都丞待解决。当前，对于cfr的研究主要集中于以下四个方面。①研究其传播机制。根据cfr阳性菌株基因环境的分析，质粒、插入元件及转座子在cfr的传播转移过程中具有重要作用。同时，对同种细菌和不同种细菌间发现的携带cfr的质粒或染色体进行分析比较推测，cfr的转移多借助于水平传播，但对其具体的传播转移机制尚不清楚。确定其具体的传播机制，则可有效避免该基因传播至人类及其他动物。②研究开发新型药物。cfr的编码产物依赖甲基化作用介导耐药，那么研制阻断或抑制甲基化作用的药物，以阻断Cfr蛋白甲基化过程，使得核糖体功能丧失，攻克细菌耐药性。另外，动物源性细菌的耐药性大多由抗生素的使用诱导产生，推行替代抗生素的中药、发酵饲料、复合微生物制剂、酶制剂等具有良好的发展前景。③完善检测技术。对于cfr的检测技术比较少，主要包括药敏试验、普通PCR和LAMP技术。建立稳、准、快的药敏试验和高效的分子生物学检测技术，对于cfr基因的监测是必不可少的。同时，多种检测方法联合应用可有效降低假阴性结果。④建立cfr多抗预测预警研究体系。该体系由刘玉庆教授提出，主张建立MRSA、VRE、NDM-1、cfr预测预警研究体系，即建立健全监测网络，划分监测区域，确定监测网点，明确监测项目，落实监测人员，配备必要的设备、设施等，通过对该基因的监测，定期分析预测，及时掌握cfr的流行情况，以有效遏制突发的公共卫生事件。

动物源性葡萄球菌携带多种耐药基因，耐药基因在不同细菌间的转移传播，容易造成大量的多重耐药。多重耐药是一个长期存在的问题，药物压力造成大量细菌耐药。在兽医临床用药方面，应根据药敏试验指导用药，切忌盲目大剂量使用抗生素。同时，加大对动物性食品耐药菌的监测，降低食物链转移耐药基因的风险。

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Advance in Multidrug Resistance Gene cfr of Staphylococcus aureus from Animals

BAO Yu1，LIU Ya-juan1，LIU Li1，PENG Xiang-wei2，ZHANG Chang-lian2
（1.College of Animal Science &Technology，Southwest University，Chongqing，400715，China；2.Poultry Institute，Chongqing Academy of Animal Science，Chongqing，400015，China）

Abstract：Staphylococcus aureus is the main pathogen of pyogenic infection，septicemia or pyosepticemia，and usually cause mastitis in dairy cattle，Staphylococcosis in chickens，tick pyemia and other diseases. Due to the abuse of antibiotics，there has been a lot of resistant Staphylococcusspp.，of which Staphylococcus spp.carrying multidrug-resistance cfr gene were widespread in animals.The encoding products of cfr gene mediate multidrug resistance to chloramphenicols，lincosamides，oxazolidinones，pleuromutilins，and streptogramin A by methylating C8of A2503in 23SrRNA.In order to provide theoretical basis for further study of transmission mechanism，development of new anti-staphylococcal drugs and establishment of cfr prediction and warning system，the present article reviewed latest advances in distribution，resistance mechanism，genetic environment and detection techniques of cfr in animal-derived Staphylococcus aureus.

Key words：Staphylococcus；cfr；resistance mechanism；genetic environment；detection technique

作者简介：保 雨（1990-），女（回族），云南昆明人，硕士，主要从事动物及动物产品检验检疫。＊通讯作者

基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金资助（CARS-43-15）

收稿日期：2014-11-30

中图分类号：S852.611

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）06-0122-04