甘草多糖对脐血源单核细胞分化为树突状细胞过程中NF-kBp65表达的影响*

唐中生,吴春朋,谢高宇,陆 莹,罗亚非

(贵阳中医学院，贵州 贵阳 550025)

甘草多糖对脐血源单核细胞分化为树突状细胞过程中NF-kBp65表达的影响*

唐中生,吴春朋,谢高宇,陆 莹,罗亚非

(贵阳中医学院，贵州 贵阳 550025)

目的 观察脐血源单核细胞分化为树突状细胞(DC)的过程中，核转录因子-kB p65(NF-kB p65)的表达以及GPS对单核细胞分化为DC的影响。方法 无菌条件下采集脐血，非连续密度梯度离心获取脐血单核细胞；用含粒单细胞刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)、脂多糖(LPS)和GPS的RPMI-1640培养液分别对细胞因子组、GPS组、联合培养组的单核细胞进行体外培养；应用倒置相差显微镜、瑞氏染色和CD86、CD83、HLA-DR、S-100的免疫细胞化学法鉴定单核细胞和DC。动态观察单核细胞分化为DC过程中不同时间点的NF-kB p65的表达，并进行图像和SPSS软件分析。结果 CD86、CD83、HLA-DR、S-100的免疫细胞化学法证实所获单核细胞和DC符合各自的形态和表型特征。在含GM-CSF和IL-4的RPMI-1640培养液培养7d时，单核细胞分化成未成熟DC(imDC)；在含GM-CSF、IL-4和LPS的RPMI-1640培养液继续培养5d时，imDC分化为成熟DC(mDC)，两者的细胞核内NF-kB p65表达具有显著性差异(P<0.05)。单纯用只含GPS的RPMI-1640培养液培养单核细胞至7d时，可见其细胞核呈NF-kBp65阳性，已分化为imDC，继续培养5d，则分化为DC。用含GM-CSF、IL-4和甘草多糖的RPMI-1640培养液联合培养7d时，则该单核细胞分化为imDC；加入LPS后继续培养5d，imDC的细胞核呈NF-kBp65强阳性，免疫细胞化学法证实imDC已经分化为DC。联合培养组细胞的表型表达均强于细胞因子组和GPS组(P<0.05)。结论 脐血来源单核细胞分化为imDC和mDC过程中，细胞核内NF-kB p65表达逐渐增强。单纯用GPS(400μg/mL)可以刺激单核细胞分化为imDC和mDC，效果逊于细胞因子GM-CSF、IL-4和LPS共同培养。

树突状细胞；细胞表面抗原；核转录因子-kB p65；甘草多糖；免疫细胞化学；脐血

树突状细胞(dendritic cell,DC)是哺乳动物体内功能最强也是唯一能激活幼稚T细胞的专职APC，它能摄取各类抗原，在机体细胞免疫和体液免疫调控中均起着重要作用。DC基因表达的特殊变化是其成熟过程中的先决条件，但是，目前对于DC特定基因的调节和信号转导还知之甚少。研究发现，核转录因子-KB(NF-kB)作为一种重要的核转录因子，调节着多种基因的表达，并参与免疫反应、细胞凋亡、肿瘤发生等多种生物学进程。NF-KB系统是由NF-KB家族及其抑制物(inhibition KB，IKB)家族共同组成的复杂体系，通常N-KB是以最常见的P50/RelA(P65)异源二聚体形式与抑制蛋白IKBs形成三聚体，以非活性形式存在于胞质中，只有在受到某些活化因素的刺激时才被激活，从三聚体中解离出来并易位于胞核，与相应的靶基因结合并调控其转录。有研究表明，人外周血单核细胞分化为imDC和mDC的过程中，细胞核内NF-kB p50表达逐渐增强[1]，而外周血单核细胞分化为imDC和mDC的过程中，细胞核内NF-kB p65的表达未见报道。前期研究结果初步表明[2]，甘草多糖(Glyeyrrhiza Polysaeeharide，GPS)可促进脐血单个核细胞来源DC的分化和成熟，增强DC的免疫学活性，尤以400μg/mL最佳。本实验中，我们拟探讨在甘草多糖(GPS)的作用下，脐血来源单核细胞分化为DC过程中，细胞核内NF-kB p65蛋白的表达变化以及GPS对单核细胞分化过程的影响，进一步探讨DC的成熟、分化及其功能之间的关系。

材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 脐血 新鲜无菌脐血(肝素抗凝)80mL，由学院一附院产科提供。

1.1.2 药物 甘草多糖(纯度>90%)购自美国泛华医药公司北京代表处。真空干燥的甘草多糖用含双抗、不含血清的RPMI-1640培养液于每次实验前配制成所需浓度的工作液，经0.45μm滤膜过滤除菌。

1.1.3 试剂 RPMI-1640培养液(GIBCO公司)，淋巴细胞分离液(Ficoll，D=1.077)，上海试剂二厂;胎牛血清(FCS)，(HyClone公司);粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)、脂多糖(LPS)，均为英国Protechec公司产品;即用型二步法非生物素检测试剂盒(PV9000)、DAB显色试剂盒、磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/LpH7.2～7.4)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.4 仪器 超净工作台，苏州安泰空气技术公司；CO2培养箱，美国Forma公司；电控恒温水浴箱，北京长安科学仪器厂；LD4-2A型离心机，上海医用分析仪器厂；电子天平，德国OHAUS公司；倒置相差显微镜，日本NIKON公司；50 cm2，150 cm2塑料培养瓶，美国GIBCO公司产品；病理图像分析系统，Motic Med CMIAS；全自动酶标仪(550型)BIO-RAD。

1.2 方法

1.2.1 单核细胞的获得 无菌新鲜脐血60 mL，加入1倍体积的RPMI-1640培养液，稀释，混匀。取50 mL试管，分别加入15 mL淋巴细胞分离液，将30 mL的稀释血小心铺于淋巴细胞分离液上，20℃、2000 rpm，离心20 min。小心吸取离心管分层液界面上的白膜层，获取单个核细胞，移入锥形离心管。重复2次。用含血清的1640将50 mL离心管中的细胞悬起来，混匀。平均滴加到两个75 cm2培养瓶中培养，收集90 min和3 h的贴壁细胞，即为单核细胞。

1.2.2 单核细胞的培养及分组 将获取的单核细胞调整浓度为5×106/mL，分为3组，细胞因子组：将5×106/mL的单核细胞置于含有10%FCS的RPMI-1640培养液内，加入GM-CSF(8×105IU/L)和IL-4(106IU/L)各40 μL，37℃、5%CO2培养箱内培养7d后，在RPMI-1640培养液内加入LPS(50μg/mL)40 μL，继续培养5d。GPS组：将5×106/mL的单核细胞置于内含等体积10%FCS的RPMI-1640培养液配制的GPS液(400 μg/mL)内培养，37℃、5%CO2培养箱内培养12 d，第7天时半量换入GPS液。联合培养组：将单核细胞加入与细胞因子组相同浓度的培养液内，先加入GM-CSF、IL-4各40 μL，后加入GPS液(400 μg/mL)，第7天时加入LPS(50 μg/mL)40 μL，继续培养5 d。

1.3 细胞离心涂片 以上各组均在第7d、第12d用无血清RPMI-1640培养液重新悬浮细胞，计数并进行细胞离心涂片，进行瑞氏染色和免疫细胞化学染色。

1.4 倒置相差显微镜观察 倒置相差显微镜下观察不同分组，处于细胞培养液中正常生活状态下的单核细胞、imDC以及mDC的形态结构特点。

5瑞氏染色 瑞氏染液滴染5min后，加入等量的蒸馏水，洗耳球吹打混匀，继续染5min。蒸馏水冲洗，吹干，95%酒精涮洗1-3秒，晾干，入二甲苯中脱蜡，封片观察。

1.6 免疫细胞化学 按试剂盒说明书进行。阴性对照采用PBS代替一抗。

1.7 图像和统计学分析 利用病理分析系统对各培养组的细胞在7d、12d进行细胞核内NF-kB p65平均吸光度(AA)测定，并采用SPSS统计学软件对其进行分析，显著性差异的界值为P<0.05。

2 结果

2.1 倒置相差显微镜观察 倒置相差显微镜下观察纯化获得的人脐血单核细胞，可见细胞呈散在贴壁生长，细胞体呈圆形，表面光滑；细胞核呈圆形，多位于中央。倒置相差显微镜下观察加入GM-CSF、IL-4的细胞因子组体外培养7d的单核细胞，可见细胞呈贴壁生长，细胞体积增大，大小不等，形态不规则。加入GM-CSF、IL-4和LPS继续培养5d，细胞多呈悬浮生长，体积较大，大小不等，细长的突起较多，有的细胞贴壁生长，呈杆状、梭状、多角形等多种形态；细胞核大而不规则，细胞质内可见空泡和颗粒状物。可见其已分化为未成熟样DC，呈现毛刺样突起，粗细不等。甘草多糖组的单核细胞培养7d后，细胞体积增大，大小不等，形态不规则(圆形、椭圆形或长梭形)，表面呈现出毛刺样突起，粗细不等，有的突起末端钝圆，有的细长，可在培养液中摆动和收缩；细胞核呈圆形，位于中央，大而不规则；(见图1)培养12d时，细胞形态呈不规则形，出现密集的毛刺样突起，呈现典型的DC形态。(见图2)联合细胞组：可见培养7d的细胞数量明显增多，细胞形态不规则，并出现长短不一、毛刺样和树枝样的细胞突起；继续培养至12d，细胞形态呈不规则形，毛刺样突起密集，已经分化为成熟DC。

图1 甘草多糖组，体外培养7d，人imDC倒置显微镜观察，可见细胞表面呈现出毛刺样突起，粗细不等。

图2 甘草多糖组，体外培养12d，人mDC倒置显微镜观察，可见细胞形态呈不规则形，出现密集的毛刺样突起。

图3 甘草多糖组，体外培养7d，人imDC瑞氏染色，光镜观察，细胞数量多，呈圆形，细胞核呈肾形或马蹄形，现细胞突起。

图4 甘草多糖组，体外培养12d，人mDC瑞氏染色，光镜观察，细胞形态不规则，细胞突起明显。

2.2 瑞氏染色 纯化获得的脐血单核细胞体积较大，大多呈圆形 ，未见细胞突起；细胞核呈现肾形或马蹄形，细胞质弱嗜碱性，染为灰蓝色。细胞因子组培养7 d的imDC，体积增大，形态不规则，出现长短不一的突起；细胞核多为圆形，有凹陷；细胞质染成蓝紫色，内含有较多的脂滴；培养至第12 d，imDC分化为mDC,其细胞体积继续增大，细胞突起增多；细胞核偏位；细胞质内有空泡。GPS组培养7 d的imDC，体积增大，形态不规则，出现长短不一的突起；细胞核多为圆形，偏位，有凹陷；细胞质染成蓝紫色，内含有较多脂滴(见图3)；培养至第12 d，imDC分化为mDC,其细胞体积继续增大，细胞突起增多；细胞核偏位；细胞质内有空泡(见图4)。联合培养组体外培养第7d时，imDC的体积比细胞因子组同时期增大，细胞数目也增多；细胞形态不规则，细胞突起较多，有的呈面纱样突起；细胞核体积也增大；细胞质染成蓝紫色，不含脂滴。体外培养第12 d时，mDC的体积更加增大，形态极不规则，呈椭圆形、多边形，细胞表面有大量毛刺样突起；细胞质内未见空泡。

2.3 免疫细胞化学结果 纯化获得的脐血单核细胞表达表面分化抗原CD86。细胞因子组培养7d后，imDC的细胞核呈NF-kB p65弱阳性，但细胞质呈较强阳性反应，显棕黄色；imDC的细胞质呈HLA-DR阳性表达。加入TNF-α继续培养5d，imDC分化为mDC，其细胞核呈NF-kB p65强阳性反应，着色深，细胞质呈弱阳性；mDC的细胞质呈HLA-DR阳性反应增强，细胞膜上也出现阳性反应，细胞核呈阴性。GPS组：体外培养7d后，单核细胞的细胞核也呈NF-kB p65弱阳性，染为棕黄色，免疫细胞化学鉴定结果显示其也分化为imDC。继续换液培养5d，imDC分化为mDC，其细胞核呈NF-kB p65强阳性反应，着色深，细胞质呈弱阳性；联合培养组：体外培养7d，单核细胞即分化为imDC，其细胞核呈NF-kB p65弱阳性，染色浅；加入TNF-α后继续培养5d，imDC即分化为mDC，可见其细胞核内出现明显的NF-kB p65强阳性反应，与细胞因子组相比较，染色深；且mDC的HLA-DR表达也增强。

2.4 图像及统计学分析结果 细胞因子组、GPS组、联合培养组3组中，GPS组可使单核细胞分化为imDC和mDC，而且第7 d和第12 d的NF-kB p65表达存在差异。3组组内比较，NF-kB p65表达随着DC的不断分化成熟而有所增加(P<0.05)；组间比较，可见联合培养组第12d mDC的NF-kB p65表达强于细胞因子组和GPS组(P<0.05)，结果如图5所示。

图5 各实验组不同时间点细胞核内NF-kB p65平均吸光度值(AA)

细胞因子组：体外培养7d的imDC与12d的mDC细胞核内NF-kB p65表达比较，两者具有显著性差异，P<0.05；GPS组：体外培养7d的imDC与12d的mDC细胞核内NF-kB p65表达比较，两者具有显著性差异，P<0.05；联合培养组：体外培养7d的imDC与12d的mDC核内NF-kB p65表达比较，两者具有显著性差异，P<0.05；联合培养组、GPS组：体外培养12d的mDC核内NF-kB p65表达，两者比较具有显著性差异，P<0.05。

3 讨论

研究结果表明[3]，核转录因子-kB(nuclear factor-kappa B,NF-kB)是从成熟B细胞中提取的，并能与免疫球蛋白K链基因增强子相结合的核因子。在哺乳动物中，NF-kB家族有p50/p105(NF-kB1)、p65(Re1A)、C-re1、p52/p-100(NF-kB2)和Re1B 5个成员。NF-kB p65作为NF-kB家族中的重要成员，在细胞生长调控中发挥着重要影响。DC是机体内重要的抗原呈递细胞，在其生长过程中，细胞的形态和免疫功能发生着重要的变化，在从抗原捕获到抗原呈递过程中，其表面分子抗原发生着很大的变化，这是因为相关靶基因的转录和表达。笔者探讨了NF-kB p65对DC生长和分化中的作用，以及加入GPS后对NF-kB p65和其它表面分子抗原在DC表达的影响。

单核细胞在含GM-CSF、IL-4的培养液内培养7d，再加入LPS继续培养5d，则分化为imDC和mDC。在分化过程中，其细胞核内的NF-kB p65含量不断增加，同时细胞表面分化抗原也发生了变化，如CD86、HLA-DR和S-100的表达均增加，结果提示，NF-kB p65在其分化成熟过程中发挥着重要的作用，并且由此可以根据蛋白变化的这个特点来推断DC在体内处于成熟分化的哪个阶段，同时也可以作为一种有用的表面标志。在单核细胞培养过程中，加入400μg/mL GPS后，培养至7d时，其细胞核内的NF-kB p65表达增加，且单核细胞转化为imDC，培养至12d时，转化为mDC。联合培养组的单核细胞在培养7d时，已分化为imDC，与GPS组比较，细胞状态更为良好，数目增多；若加入LPS继续培养5d时，细胞在形态学上完整，细胞突起增多，且细胞核内NF-kB p65表达增加。

作为专职的抗原呈递细胞，国、内外已经逐渐重视DC疫苗在抗肿瘤治疗领域的应用，成为当今肿瘤免疫治疗的热点[4-6]。如何提高其呈递抗原的效率以及提高其对肿瘤的杀伤率有着很重要的意义。本实验观察了NF-kB p65在DC成熟过程中的变化，再结合NF-kB家族中其它成员的表达变化可以作为判断体内DC处于何种发育分化阶段，从而可以加入其它一些因素来促进DC的成熟，增强人体的免疫力和DC抗肿瘤的能力。

甘草为常用中药，性味甘平，归心、肺、脾、胃经，具益气补中，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和药性之功效。甘草的有效成分主要是甘草甜素、甘草次酸、甘草苷元和甘草多糖。甘草多糖(GPS)主要由鼠李糖、葡聚糖、阿拉伯糖和半乳糖组成。药理研究发现[7]，GPS具有调节机体免疫、抗肿瘤、抗病毒、防治骨关节炎、抗氧化等作用，而且无细胞毒作用。GPS能明显提高小鼠的生长性能和T细胞的E玫瑰花环数量[8]，能诱导激活淋巴细胞，提高其能量代谢水平和IL-2的分泌，具有免疫调节作用[9]，对小鼠机体免疫有增强作用[10]。GPS也可能通过降低荷瘤小鼠Treg细胞的比例及提高脾淋巴细胞转化率而发挥抗肿瘤免疫调节作用[11]，GPS可有效抑制大鼠肝肿瘤的生长[12]。孙氏等研究表明：GPS能够促进人外周血γδT细胞增殖、分泌细胞因子及杀伤肿瘤细胞[13]。但GPS对DC的信号转导通路尚未见报道。在本实验中，GPS对DC的信号转导通路，细胞的生长、分化以及功能有着一定的影响。GPS可以替代细胞因子的作用使单核细胞分化成为DC，且细胞形态更为明显，细胞突起增多，细胞表面分子抗原表达增多，但逊于细胞因子与甘草多糖联合培养。实验结果表明，GPS可以替代各种因子发挥促进脐血来源单核细胞分化为DC的作用。

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贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究课题(NO：QZYY2010-04)，贵州省科技厅和贵阳中医学院联合基金课题(NO：黔科合中药字〔2011〕LKZ7036号)，贵州省科学技术基金项目(NO：黔科合J字〔2012〕2078号)。

唐中生(1977.08-)，男，贵州遵义人，硕士，副教授，主要从事树突状细胞生物学的研究。Tel：13885085968，E-mail：tzs351213@126.com。

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1007-2349(2015)10-0060-04

2015-07-05)