贲门腺癌患者癌组织RKIP基因甲基化和mRNA表达情况及其临床意义

魏红，谷俊霞，刘建霞，徐亮，李丽东，李华，董稚明，张向阳

·论著·

贲门腺癌患者癌组织RKIP基因甲基化和mRNA表达情况及其临床意义

魏红，谷俊霞，刘建霞，徐亮，李丽东，李华，董稚明，张向阳

目的研究贲门腺癌患者癌组织RKIP基因甲基化和mRNA表达情况及其临床意义。方法选择2008—2013年河北工程大学附属医院收治的贲门腺癌患者160例，采用以Taq Man探针为基础的实时定量聚合酶链反应(PCR)和反转录－聚合酶链反应(RT－PCR)检测贲门腺癌患者癌组织及癌旁正常组织RKIP基因甲基化和mRNA表达情况。结果贲门腺癌患者癌组织RKIP基因甲基化发生率为68.1%(109/160)，高于癌旁正常组织的35.6%(57/160)(χ2=33.843，P=0.000)。不同年龄、性别、临床分期贲门腺癌患者RKIP基因甲基化发生率比较，差异无统计学意义(P＞0.05);不同病理分级及有无淋巴结转移贲门腺癌患者癌组织RKIP基因甲基化发生率比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。贲门腺癌患者癌组织RKIP基因mRNA阳性表达率为48.1%，低于癌旁正常组织的71.9%(χ2=18.802，P＜0.01)。癌组织RKIP基因甲基化患者RKIP基因mRNA阳性表达率低于癌组织RKIP基因非甲基化患者(χ2=6.410，P＜0.01)。结论RKIP基因甲基化导致该基因mRAN表达缺失可能是贲门腺癌的发病机制之一，且RKIP基因的高甲基化与贲门腺癌患者病理分级和淋巴结转移有关。

贲门腺癌;RKIP基因;甲基化;基因表达

魏红，谷俊霞，刘建霞，等.贲门腺癌患者癌组织RKIP基因甲基化和mRNA表达情况及其临床意义［J］.实用心脑肺血管病杂志，2015，23(3):43－46.［www.syxnf.net］

Wei H，Gu JX，Liu JX，et al.Methylation and mRNA expression of RKIP gene in cancerous tissue of patients with cardia adenocarcinoma and its clinical significances［J］.Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(3):43－46.

贲门腺癌是临床常见的消化道肿瘤，但其发现时大多已是中晚期，患者预后差，因此对贲门腺癌发病机制及早期诊断的研究日益受到临床医疗工作者的重视［1］。有研究证实，RKIP是一种潜在的肿瘤抑制基因，其表达水平与人类多种恶性肿瘤的转移能力呈负相关，且与患者预后有关，RKIP表达下调/缺失者预后差［2－5］。本研究采用以Taq Man探针为基础的实时定量聚合酶链反应(PCR)和反转录－聚合酶链反应(RT－PCR)检测贲门腺癌患者的癌组织及癌旁正常组织RKIP基因甲基化及其mRNA表达情况，分析RKIP基因甲基化在贲门腺癌患者中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2008—2013年河北工程大学附属医院收治的贲门腺癌患者160例，其中男118例，女42例;年龄37～83岁，平均(61.8±8.7)岁;标本切取后立即保存于液氮中，制作蜡块进行回顾性阅片，按国际抗癌联盟(UICC)进行临床分期:Ⅰ～Ⅱ期70例，Ⅲ～Ⅳ期90例;病理分级:高分化41例，中分化54例，低分化65例;有淋巴结转移者92例，无淋巴结转移者68例。术前未行放化疗，标本经病理检查证实，患者均知情同意。

1.2 主要试剂和仪器PCR扩增仪Mastercycler5333 (德国eppendorf公司)，紫外分光光度仪TU－1800 PC (北京普析通用仪器)，PCR引物(上海捷瑞生物技术有限公司)，Trizol试剂(北京赛百盛生物技术有限公司)，反转录试剂盒(Reverse Transcription System A3500，Promega公司)，QZAamp DNA FFPE Tissuekit试剂盒，EZ DNA Methylation－goldTMKit(D5005)试剂盒。

1.3 方法采用以Taq Man探针为基础的实时定量PCR和RT－PCR检测贲门腺癌患者癌组织及癌旁正常组织RKIP基因甲基化及其mRNA表达情况。

1.3.1 以Taq Man探针为基础的实时定量PCR每个样本均取10 μg DNA，用2 mol/L氢氧化钠(NaOH)变性处理［6］，此样本经蛋白酶K(Merck公司产品)消化，用QZAamp DNA FFPE Tissuekit试剂盒提取组织DNA，紫外分光光度计测量其纯度，比值选择在1.6～2.2。用EZ DNA Methylation－goldTMKit(D5005)试剂盒修饰DNA，使未甲基化的DNA的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)。PCR反应体系为25 μl:DNA模版2.5 μl;甲基化上游引物序列为5'－CGTTCGATCGTGGACGTGT－3'(115 bp)，甲基化下游引物序列为5'－GACGAACAACGTCTTATTACAACGC－3' (115 bp)，上、下游引物各10 μl;检测RKIP非甲基化的上游引物序列为5'－TGGTCATCCAGGTTTAGTAACT－ 3'(200bp)，下游引物序列为AACCAATAAACCTACTCCTCCCTTAA－3'(200 bp)，量同甲基化引物;探针FAM 0.4 μl(10 pmol/L);Taq PCR Master Mix 10 μl×2;ROX 0.4 μl。PCR反应条件: 95℃预变性5 min;95℃30 s，53℃45 s，72℃45 s，42个循环;72℃继续延伸10 min。选择经Sss甲基化酶处理的无任何肿瘤的正常人外周血中有核细胞的DNA作为阳性对照，未经处理的正常人外周血DNA作为阴性对照。DNA模版用灭菌双蒸水取代作为空白对照。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，用UV凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析，产物长度均为169 bp。随机抽取15%的标本进行重复试验。扩增产物得到预期大小的甲基化片段，空白对照无产物。RKIP基因甲基化状态有3种表现:(1)目的条带由甲基化引物扩增出来，而非甲基化引物无条带扩出，此为甲基化;(2)目的条带由非甲基化引物扩增出来，而甲基化引物未扩增出目的条带，此为非甲基化;(3)甲基化引物和非甲基化引物均由目的条带扩增出来，则为不完全甲基化，统计为甲基化(RKIP基因电泳图见图1)［7］。

1.3.2 RT－PCR技术按Trizol试剂说明书提取总RNA(Invitrogen公司)并参照反转录试剂盒说明将RNA反转录成cDNA。合成RKIP mRNA的上游引物序列为5'－TCCTCTTCATATTGCGGCTT－3'，下游引物序列为5'－CTTGAGCACCTTTTCCCAGAA－3';GAPDH的上游引物序列为5'－TGAACCGGCATCTGCACAC－3'，下游引物序列为5'－CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG－3';PCR反应体系为25 μl:cDNA 2.5 μl，目的基因和内参照基因的上下引物各4 μl;反应条件:RNA 94℃变性3 min，95℃15 s，68℃30 s，72℃90 s，最后72℃延伸10 min。

1.4 统计学方法采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理，计数资料采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RKIP基因甲基化贲门腺癌患者癌组织RKIP基因发生甲基化109例(68.1%)，癌旁正常组织RKIP基因发生甲基化57例(35.6%)，癌组织RKIP基因甲基化发生率高于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2= 33.843，P=0.000)。

2.2 RKIP基因甲基化与临床病理特征的关系不同年龄、性别、临床分期贲门腺癌患者RKIP基因甲基化发生率比较，差异无统计学意义(P＞0.05);不同病理分级及有无淋巴结转移贲门腺癌患者癌组织RKIP基因甲基化发生率比较，差异有统计学意义(P＜0.05，见表1)。

图1 贲门腺癌患者癌组织及癌旁正常组织RKIP基因电泳图Figure 1 Electrophoregram of RKIP gene in cancerous tissues and correspondingnormaltissueofpatientswith cardia adenocarcinoma

表1 贲门腺癌患者临床病理特征与癌组织RKIP基因甲基化的关系(例)Table 1 Relationship between clinicopathologic features and RKIP gene methylationincanceroustissuesofpatientswith cardia adenocarcinoma

2.3 RKIP基因甲基化与其mRNA表达的关系贲门腺癌患者癌组织RKIP基因mRNA阳性表达77例，阳性表达率为48.1%;而癌旁正常组织RKIP基因mRNA阳性表达115例，阳性表达率为71.9%。癌组织RKIP基因mRNA阳性表达率低于癌旁正常组织，差异有统计学意义(χ2=18.802，P＜0.01)。癌组织RKIP基因甲基化患者109例，其中RKIP基因mRNA阳性表达45例，阴性表达64例;癌组织RKIP基因非甲基化51例，其中RKIP基因mRNA阳性32例，阴性19例。癌组织RKIP基因甲基化患者RKIP基因mRNA阳性表达率低于癌组织RKIP基因非甲基化患者，差异有统计学意义(χ2= 6.410，P＜0.01)。

3 讨论

RKIP是1999年Yeung等［8］发现的，因其与人磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)及Raf－1结合后具有调节Raf－1/MEK/ERK信号通路的作用而命名。免疫组织化学分析结果表明，RKIP在许多组织的细胞质及细胞膜上均有表达，且通过静电作用与带负电荷的膜进行结合［9］。Fu等［10］研究发现，RKIP具有抑制肿瘤细胞转移的作用，因此临床对其在各种肿瘤中的甲基化、表达、失活原因及对临床指导价值等进行了广泛而系统的研究，认为肿瘤发生早期阶段RKIP具有基因甲基化事件。基因甲基化是肿瘤发生发展过程中的早期事件，本研究结果显示，贲门腺癌患者癌组织RKIP基因甲基化发生率为68.1%，高于癌旁正常组织的35.6%，表明RKIP基因高甲基化是贲门腺癌发生的早期信号。同时本研究结果显示，RKIP基因甲基化与临床分期无关，原因可能是不同类型肿瘤抽样误差引起。另外，本研究观察到，癌旁组织约34%表现为不完全甲基化，可能与本研究采用以Taq Man探针为基础的实时定量PCR进行检测有关，因其灵敏度较高，低于总DNA的5%的等位基因时甲基化即可被检测出来［11］，还有手术切除过程中微量肿瘤组织混入正常黏膜组织也可表现为甲基化［12］。

本研究进行的前期研究结果发现，RKIP基因甲基化发生率与贲门腺癌患者的临床分期无关，为此本研究增加了样本量，且抽取了15%的标本进行重复试验，因此结果较可信。同时本研究结果还发现，贲门腺癌患者癌组织RKIP基因甲基化发生率与病理分级和淋巴结转移有关，表明RKIP基因的高甲基化对肿瘤具有加深侵袭深度和促进淋巴结转移的作用。RKIP基因定位于人体细胞的细胞质和细胞膜上，对细胞过分增殖具有抑制作用，其可以稳定染色体，防止基因突变，促进细胞凋亡、分化，进而起到控制肿瘤发生和转移的作用，这在直结肠癌和胃癌中已得到证实。

RKIP作为Raf－1/MEK/EPK信号转导通路中的调节因子，在良性黑色素细胞中表达最高、黑色素瘤次之、转移黑色素瘤表达最低，RKIP过表达能下调BRaf的活性，RKIP强制性表达能致瘤B－Raf转化的黑色素瘤部分恢复到非转化状态，提示肿瘤细胞的增殖和浸润能力及转移概率均与RKIP表达下降有关。本研究结果显示，贲门腺癌患者癌组织RKIP基因的mRNA阳性表达率(48.1%)低于癌旁正常组织(71.9%)，且贲门腺癌患者癌组织RKIP基因甲基化与其mRNA表达有关，表明贲门腺癌患者癌组织RKIP基因启动子区甲基化与该基因mRNA表达的缺失有关。然而Zhu［13］等研究指出，RKIP具有促进细胞迁移的作用，RKIP在犬肾细胞(MDCK细胞)中过表达对细胞迁移有促进作用，但其在人前列腺癌中过表达可降低浸润能力、抑制肿瘤转移，两种不同的结果表明，RKIP在Raf－1/MEK/ EPK信号转导通路中的调节具有正性和负性作用，因此

RKIP在不同类型肿瘤中通过不同方式抑制或促进肿瘤的转移和浸润。

综上所述，RKIP基因高甲基化导致该基因mRNA表达缺失可能是贲门腺癌的发病机制之一，且RKIP基因的高甲基化与贲门腺癌患者的病理分级和淋巴结转移有关，可考虑将其作为评估贲门腺癌恶性程度和判断预后的指标。

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Methylation and mRNA Expression of RKIP Gene in Cancerous Tissues of Patients with Cardia Adenocarcinoma and Its Clinical Significances

WEI Hong，GU Jun－xia，LIU Jian－xia，et al．
The Affiliated Hospital of Hebei Engineering University，Handan 056002，China

ObjectiveTo observe the methylation and mRNA expression of RKIP gene in cancerous tissues of patients with cardia adenocarcinoma，to explore its clinical significances.MethodsFrom 2008 to 2013，a total of 160 patients with cardia adenocarcinoma were selected in the Affiliated Hospital of Hebei Engineering University，and Taq Man probe－based real－time quantitative PCR and RT－PCR were used to detect methylation and mRNA expression of RKIP gene in cancerous tissues and corresponding normal tissues.ResultsThe methylation rate of cancerous tissues was 68.1%，was higher than that of corresponding normal tissues of 35.6%(χ2=33.843，P=0.000).No statistically significant differences of methylation rate was found in patients with different ages，gender or clinical stages(P＞0.05);but there was statistically significant differences of methylation rate in patients with different pathological gradings and with or without lymphatic metastasis(P＜0.05).The positive expression rate of RKIP gene mRNA of cancerous tissues was 48.1%，was lower than that of corresponding normal tissues of 71.9%(χ2=18.802，P＜0.01).The positive expression rate of RKIP gene mRNA of patients with RKIP gene methylation was lower than that of patients without RKIP gene methylation(χ2=6.410，P＜0.01).ConclusionThe incomplete expression of RKIP gene mRNA caused by RKIP gene methylation may play a role in the mechanism of cardia adenocarcinoma，and the methylation of RKIP gene is correlated with pathological gradings and lymphatic metastasis.

Cardiac adenocarcinoma;RKIP gene;Methylation;Gene expression

R 735.2

A

10.3969/j.issn.1008－5971.2015.03.012

2014－12－13;

2015－03－05)

(本文编辑:谢武英)

河北省科技攻关计划项目(14277765D)

056002河北省邯郸市，河北工程大学附属医院(魏红，谷俊霞，刘建霞，徐亮，李华，张向阳);邯郸市第四医院(李丽东);河北省肿瘤研究所(董稚明)