兔病毒性出血病病毒VP60蛋白基因研究进展

李桂黎，任冉阳，胡 凌，杨泽晓

（四川农业大学动物检疫实验室，四川雅安 625014）

兔病毒性出血病（Rabbit haemorrhagic disease RHD）又称兔瘟，是由兔出血病病毒（Rabbit haemorrhagic disease virus RHDV）引起的兔的一种急性、烈性、高度传染性和高度死亡性的疾病，曾给世界养兔业带来了非常严重的经济损失［1］。该病于1984年在我国江苏省首次被发现，后来在世界各地陆续有发生和流行的报道。自确定该病病原为RHDV后，人们对RHDV进行了比较系统的研究，尤其近年来在分子水平对RHDV进行的研究越来越多，在RHDV的病原学、诊断学和遗传变异学上都有了许多新的进展［2］。研究表明，VP60蛋白是RHDV的核衣壳蛋白，也是它唯一的结构蛋白，在病毒诱导免疫的过程中起着重要的作用，是病毒的免疫保护性抗原［3］。因此，对于VP60蛋白基因结构和功能等方面的深入研究，必将为RHDV的发病机理、诊断试剂的开发和新型疫苗的研制等提供参考材料和理论依据。为了梳理国内外近期在RHD防控研究中取得的主要进展，本文对RHDV VP60蛋白基因的结构特征和相关研究应用进行了概述。

1 RHDV基因组和VP60基因

RHDV是在20世纪90年代早期才被定义为杯状病毒科病毒，呈球形，没有囊膜，大小为35nm～40nm。RHDV是单股正链RNA病毒，总共有7 437个核苷酸，分子质量为2.4×103ku～2.6×103ku，基因组结构包含2个开放阅读框（open reading frame，ORF）。ORF1编码分子质量为256ku的大蛋白，裂解后可分为2C解旋酶（80ku）、3C样蛋白酶和3D样聚合酶（73ku）、1个保守区（43ku）及核衣壳蛋白 VP60（60ku）；ORF2，编码 VP10蛋白（12.9ku）［4］。其中，VP60蛋白是 RHDV 的结构蛋白，有2个主要的抗原区域，分别位于N端的第31位到250位氨基酸之间和C端的第477位到第579位氨基酸之间［5］。VP60蛋白由2个同心圆组成，其N端部分组成内壳，包括A、B区，具有很高的抗原免疫性；其C端部分组成外壳，包括C区～F区，又可分为P1和P2两个亚结构域，其中P2区域暴露在病毒表面，是病毒表面的抗原决定簇。金明兰等［6］对分离到的YL毒株VP60基因进行扩增分析发现，VP60蛋白 A、B、D、F区变异相对较低，C、E区变异较高，因而推测A、B、D、F区在衣壳蛋白中执行更多的生物学功能。

在对RHDV感染肝脏组织的研究中发现，病毒粒子还含有一条约2.2ku大小的亚基因组RNA（subgnomic mRNA，sgRNA）。sgRNA 只有 一 个ORF，在其5′端共价结合Vpg蛋白，与基因组仅有2个碱基差异的16碱基保守序列，在3′端也有poly（A）尾，并且其1／3的序列与基因组RNA相对应的序列部位相同，其表达产物与基因组编码的VP60相同，提示sgRNA也可有效的合成VP60蛋白［7］。因此认为，VP60蛋白既可以有多聚蛋白解体而来，也可以由亚基因组sgRNA翻译而来，但是还有待更直接的证据证实。

2 RHDV VP60蛋白基因的变异

VP60蛋白是RHDV的主要结构蛋白，能够诱导机体产生免疫反应，因此VP60基因成为各分离株地域之间、亲缘关系等分子流行病学调查的首选基因。刘怀然等［8］扩增了不同毒株RHDV VP60基因，并进行克隆测序，其结果在GenBank进行对比，其核苷酸同源性为91%～98%，氨基酸同源性为94%～99%，且氨基酸的变异并没有引发VP60蛋白高级结构的变化，进一步表明VP60基因的保守性。近几年，隋慧等［9］对CD株的主要抗原表位基因进行扩增测序，结果发现CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97.5%，与其他毒株同源性为92.0%～96.6%之间；氨基酸序列同源性最高为99.4%，与其他毒株同源性为96.6%～98.3%。杨丽梅等［10］通过对ZB株的克隆分析，表明ZB株VP60基因核苷酸序列与其他株的同源性为92.5%～97.9%。这些研究都表明，VP60蛋白基因核苷酸序列遗传变异相对稳定，具有高度保守性。在国外，Alda F 等［11］分离了伊伯利亚半岛野兔中的RHDV，对它们的VP60基因进行对比分析，指出RHDV在进化过程中，在基因群之间的遗传距离有逐渐增大的趋势。随着遗传距离的增大，会不会影响RHDV的抗原性和致病性的改变还有待进一步研究。

3 VP60蛋白基因在RHDV检测中的研究

临床实践中RHD的诊断主要靠临床症状和剖检，结合病毒分离和血凝抑制试验进行综合判定。由于VP60蛋白基因核苷酸序列遗传变异相对稳定，具有高度保守性，因此国内外研究者以VP60蛋白基因为基础在RHDV检测方面进行了大量研究，并建立了很多科学可靠的检测技术，主要包括分子生物学检测技术和免疫学检测技术。

3.1 分子生物学检测技术

3.1.1 RT-PCR RT-PCR方法检测RHDV特异性强，敏感度高，重复性好，不仅可用于RHD的临床诊断，也可以用于市场上兔肉制品的检疫。胡波等［12］根据GenBank上公布的VP60基因的序列，设计了一对特异性引物，目的片段长度为591bp，经过优化条件，建立了兔群鼻拭子中的RHDV的RTPCR检测方法，经检验，该方法有很好的检出率。王印等［13］根据GenBank上公布的RHDV和欧洲野兔综合征病毒（EBHSV）的VP60基因的序列，设计特异性引物，建立了RHDV和EBHSV的复合RTPCR检测方法，对2种病毒目的基因的检测限度可达50copies，为RHD和EBHS的诊断提供了一种技术手段。

3.1.2 RT-LAMP 环介导等温扩增技术（loopmediated isothermal amplification assay，LAMP）是近年来新兴的一种崭新的DNA扩增技术，具有简单快速，特异性强，灵敏度高，结果判定简单，成本低廉等特点，有着极为广泛的应用。Yuan D等［14］针对VP60基因保守序列，设计合成了内、外两对引物，在Bst DNA聚合酶的作用下完成反应，并对条件进行优化，结果表明，该方法简单快捷，特异性好，灵敏度比普通的RT-PCR方法高出100倍，对于临床样品的检测结果也显示比RT-PCR方法具有更高的检出率。RT-LAMP检测技术不仅节约时间，还可以通过裸眼进行结果判读，在国内基层临床RHD诊断中具有广阔的应用潜力。

3.2 免疫学检测技术

3.2.1 ELISA VP60蛋白是RHDV的衣壳蛋白，也是它的保护性抗原，在诱导宿主免疫反应中起着重要作用，也是RHD免疫学诊断首选的蛋白。董婷等［15］以抗RHDV多克隆抗体为包被抗体，以抗RHDV VP60单克隆抗体为检测抗体，建立了RHDV双夹心ELISA检测方法，该方法敏感性高，特异性强。马力等［16］利用ZB株RHDV VP60序列为模板，扩增了该基因并进行原核表达，纯化出该蛋白，并以该蛋白为诊断抗原，初步建立了检测RHDV抗体的间接ELISA诊断方法。李云琴等［17］也利用原核表达建立了RHDV VP60-ELISA诊断方法，经验证，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。研究表明，利用RHDV VP60蛋白的重组蛋白建立的ELISA方法，特异性好，敏感性高，也是可以用于RHDV检测的免疫学技术。

3.2.2 胶体金免疫层析法 蔡少平等［18］用胶体金标记纯化的RHDV多克隆抗体，以杆状病毒表达系统表达的重组RHDV VP60蛋白为免疫原制备RHDV的单克隆抗体，将这种单克隆抗体和羊抗兔IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，经优化制成RHDV免疫胶体金试纸条。检测结果发现该试纸条敏感性高于HA，是一种快速、灵敏、特异的检测方法。免疫胶体金技术除了敏感特异以外，最主要的优势是不需要特殊工具和读判仪器，更加适宜临床实践中快速简便的使用，因此具有广泛的应用前景。不过到目前为止尚未见到商品化用于RHDV检测的胶体金试纸条生产，其应用有待进一步开发研制。

4 VP60蛋白基因在疫苗预防方面的研究

目前生产上预防兔病毒性出血病的疫苗主要是组织灭活疫苗，但是其免疫效果常常受到各种因素的影响，并且尚未发现能够让RHDV稳定生长的细胞系，研发新型疫苗已经成为一种重要趋势。鉴于RHDV只有一个血清型，其VP60蛋白具有良好免疫原性，基因又相对比较保守，为新型疫苗研制提供了前提和基础，国内外很多学者采用多种表达系统对VP60蛋白进行了表达［19］。

4.1 原核表达

大肠埃希菌的原核表达系统是实验室常用的表达系统。Boga J A 等［20］早在1994年就对 VP60蛋白进行了原核表达，并具有良好的免疫效果。在国内，严维巍等［21］在2003年也对VP60蛋白在BL21株大肠埃希菌中进行了表达，其蛋白与天然衣壳蛋白具有相似性。随后，肖跃强等［22］建立了相应的大肠埃希菌表达系统，并检测表明该蛋白具有良好的免疫原性，具备了作为亚单位疫苗的条件，这为亚单位疫苗的研究提供了重要参考。

4.2 真核表达

严维巍等［23］将VP60基因插入酵母转移载体中转化毕赤酵母菌GS115株，筛选获得充足酵母菌，并经过Western blot检测表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。陈柳等［24］利用杆状病毒表达系统表达RHDV结构蛋白VP60的重组杆状病毒，经检测VP60可在昆虫细胞中表达，且能够组装形成病毒样颗粒。谭晖等［25］和 Gao J等［26］重组嵌合 VP60基因，并利用杆状病毒表达系统，转染至Sf9昆虫细胞，并都得到表达的蛋白，且都可以形成与VP60蛋白类似的病毒样颗粒。Cheng Y等［27］成功构建了真核表达质粒，并转染至BKH-21细胞，成功表达蛋白，并且具有免疫原性。Yuan D等［28］构建了pcDNA-VP60真核表达质粒，并转染至RK13细胞中，将构建好的质粒作为核酸疫苗注射小鼠，并检测其抗体水平，结果表明该真核表达质粒能够诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答。

4.3 其他表达

也有学者采用转基因技术进行了口服疫苗的研究探索，李传山等［29］建立了串叶松香草高效再生体系，并筛选到了2株拟转基因植物；唐广立等［30］建立了百脉根高频再生体系，成功构建了植物表达载体；Mikschlfsky H 等［31］采用了4种不同的植物表达VP60蛋白，得出烟草和豌豆表达系统表达的蛋白可溶性较高，免疫兔后可产生抗体反应。利用转基因植物表达VP60进行口服免疫，为RHD的预防和控制提供了一条新的思路和奠定了基础。

5 结语

兔病毒性出血病是在20世纪末期暴发的兔急性烈性传染病，严重危害养兔业，加强对RHD诊断技术和新型疫苗的研究对该病的预防和控制都有非常重要的意义。VP60基因是RHDV的核衣壳蛋白，也是唯一的结构蛋白，其序列的相对保守性使得在研究RHDV分子诊断技术和新型疫苗方面都作为首选的基因。近年来以VP60基因为基础在RDHV病原学、诊断和预防等方面的研究成果比如RT-PCR、环介导等温扩增技术、胶体金免疫试纸等许多新的检测诊断技术，以及其原核表达、真核表达产物的良好免疫原性试验都显示出了非常广阔的应用前景，并且为RHD的快速诊断和新型疫苗的研究奠定了基础和提供了一些新的方法和思路。相信随着人们对VP60蛋白基因研究的不断深入，VP60在RHD防控的基础性研究、诊断技术发展和新型疫苗研制等方面的重要作用会逐步显现，也会以此为基础找到更理想的RHD的防控方法，为我国养兔业持续健康稳定发展提供保障。

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