猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗研究进展

厚华艳，梁 武，2，吕茂杰，杨保收＊

（1.天津瑞普生物技术股份有限公司瑞普生物研究院，天津 300308；2.中国农业大学动物医学院，北京 100094）

猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae，App）引起的高度传染性、致死性的呼吸道疾病。该病的主要病变特征为肺部出血、坏死和纤维素性渗出，呈急性和慢性临床特征，各年龄段猪只均可感染，感染且未死亡猪只呈生长缓慢或无症状带菌，成为主要传染源，给养猪业造成巨大的经济损失。目前，以荚膜多糖的组成和结构为依据已发现有15个App血清型，其各个血清型的荚膜多糖都有独特的结构组成，在免疫学上不同于其他型。根据App的生长是否需要NAD因子（烟酰胺腺嘌呤二核甘酸）将App分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型2个生物型，生物Ⅰ型即为依赖外源NAD因子才能生长，菌株毒力强，生物Ⅱ型生长过程中不需要NAD因子，菌株毒力弱。以荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）的抗原性为依据可将生物Ⅰ型App分为13个血清型（1～12，15），其中5型分为5a和5b两个亚型，将生物Ⅱ型App分为两个血清型（13，14）。每个血清型毒力不同但均可引发疾病。PCP的致病因子是其在宿主体内定殖、持续感染及引起呼吸道及肺部损伤相关的毒力因子，主要有外毒素、脂多糖、荚膜多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、蛋白酶和菌毛等，其中外毒素是App引起宿主肺部损伤最重要的毒力因子［1］。

App对头孢噻呋、氟苯尼考、地米考星等抗菌药比较敏感［2］，但长期使用抗菌药极易造成抗药性及肉制品的药物残留，因此疫苗接种成为预防和控制本病行之有效的措施。全菌体灭活苗是预防PCP的“第一代疫苗”，是猪传染性胸膜肺炎的传统疫苗，它的优点是安全、不存在散毒和造成新疫源的危险，不会返祖返强，便于储存和运输，但是其保护力有限。灭活疫苗作为一种“死”苗，在灭活过程中某些抗原的免疫原性遭到破坏，最终影响其免疫效果，菌影疫苗也是一种“死”苗，实际是细菌的空壳，它是利用噬菌体ΦX174的E基因在革兰阴性菌中表达后，在菌体上形成一个通道，使细菌的细胞质及DNA都流失到体外，最终引起细菌的裂解失活而制备的一种疫苗，该疫苗菌体衣壳部分完整，具备良好的免疫原性，但其同灭活疫苗一样缺乏分泌的外毒素，因此其交叉保护力有限［3］。弱毒活疫苗可提供针对多种血清型的交叉保护力，免疫效果强于灭活疫苗，但是弱毒株遗传背景不明确，在基因上没有被限定，在应用中存在着毒力返强的危险。

随着App毒力因子致病性及免疫原性研究的不断深入，人们发现App的某些毒力因子，尤其是生长过程中分泌到外界的Apx毒素在免疫保护中发挥重要作用。因此毒力因子相关的亚单位疫苗的研究开始引起人们的重视。本文主要针对猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的候选抗原、抗原制备、重组亚单位疫苗等方面进行综述。

1 常规亚单位疫苗

1.1 菌体表面结构

荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）及脂蛋白等菌体表面结构是最初经鉴定具有免疫原性的物质［4］。但是，CPS、LPS及OMP有很高的异源性，免疫动物不能对异源的血清型产生保护。脂蛋白有很高的免疫原性和免疫保护性，使用弱的去污剂处理可以促使菌体外膜释放具免疫原性的脂蛋白，这种细胞释放的上清物质（cell-free supernatant，CFS）可以用于制备非重组亚单位疫苗［5］。但是评价OMP和脂蛋白产生的免疫保护性仅限于康复期血清的免疫印迹试验，而对于在动物体内的免疫保护性还存在很多争议。比如，Van Den Bosch H 等［6］发现在免疫猪体内与免疫血清具有反应性的PalA对PCP没有免疫保护性；Neil J O等［7］发现高度保守并具免疫原性的外膜蛋白comL、lolB、lppC、ompA不能对PCP产生免疫保护作用。

Ⅳ型菌毛在App其致病过程中发挥重要作用，ApfA蛋白是其主要亚单位蛋白，且其在App血清型中有很高同源性。Lenka S等［8］、Zhou Y 等［9］均认为ApfA蛋白有很高免疫原性可作为App亚单位疫苗的候选抗原。

1.2 铁摄取系统

App的铁摄取系统包括转铁蛋白、血红蛋白、铁络环肽和氧肟酸盐铁载体等，铁摄取相关蛋白具有免疫保护性可作为亚单位疫苗的候选抗原。60、62、65ku的转铁蛋白B存在于所有App血清型中，60 ku的Tbp免疫猪后仅对同源的血清型产生有限的保护性。铁络环肽和血红蛋白受体FhuA和HgbA在所有的App血清型中都很保守，猪只感染试验显示血红蛋白受体HgbA是很重要的毒力因子可以做为亚单位疫苗的候选抗原［10］。TonB2周质蛋白在细胞质膜到外膜受体质子运输过程中发挥作用，Liu J等［11］发现TonB2是App的重要抗原并能产生有效保护作用。

1.3 外毒素

外毒素（Actinobacilluspleuropneumoniae-RTX-toxin，Apx）是由多种革兰阴性细菌产生的一种外毒素，该毒素含有富含甘氨酸和天冬氨酸的调控元，在C端有9次～40次的重复，此调控元可以结合钙离子，是毒素生物活性的关键。Apx毒素是App的主要毒力因子，属于分泌型RTX家族成员，并具有很强的免疫原性和免疫保护性。Apx毒素中和抗体保护中性粒白细胞免于被杀并使其有效清除细菌。免疫猪通过气雾法攻毒App 1型可以产生IgG1亚类抗溶血素抗体。提纯ApxⅠ和ApxⅡ制备的溶血素疫苗在猪体内可以对App 1型产生很好的保护性［12］。Apx毒素和其他细菌的复合物组合的免疫试验显示，Apx毒素在抵抗细菌侵袭中是不可或缺的。目前，几乎所有商业化的App亚单位疫苗比如“二代疫苗”都包含Apx毒素。

1.4 其他毒力因子

App有很多毒力因子只能在体内表达（比如ApxⅣ），但有研究数据显示支气管肺泡液可上调ApxⅣ基因的表达，Buettner使用PPLO培养基在铁限制条件诱导ApxⅣ基因的表达，并首次在体外培养的 App的 DIVA（differentiating infected from vaccined animals，DIVA）亚单位疫苗中鉴定到 ApxⅣ蛋白［13］。目前有效亚单位疫苗抗原的发现还是很有限的，还需要更有力的基因工程及遗传学方法。

尽管App有很多毒力因子及具有免疫原性的蛋白，但单一抗原组分的亚单位疫苗只能提供部分保护，且交叉保护力弱。在PCP亚单位疫苗研究中，多以Apx毒素为主要成分，多种抗原组合的亚单位疫苗为主，其免疫效果明显高于单一组分的亚单位疫苗。Van Den Bosch H 等［6］将3种毒素和转铁蛋白为组分的亚单位疫苗与灭活疫苗的免疫效果相比较，发现前者免疫组的发病率低、肺部病变显著减少。Porcilis App是一种包含 ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和42ku OMP的一种亚单位疫苗，可诱导产生交叉保护，并产生高水平的相应抗体［12］。在法国、意大利、荷兰、瑞士、澳大利亚等国家进行的田间试验进一步证明，该疫苗可以极其显著地降低死亡率和临床症状，几乎无肺部损伤。

2 PCP亚单位疫苗抗原成分制备

2.1 CPS、LPS、OMP制备

Willson P J等［14］利用盐析法提取1型 App的细胞碎片，包括多糖、LPS和OMP蛋白等物质与相应佐剂混合制成疫苗，免疫猪可获得免疫保护性。关于PCP亚单位疫苗抗原成分CPS、LPS及OMP的制备方法，刘霞等［15］用十六烷基溴化铵-无水乙醇法制备App的CPS，用酚-水法制备LPS，用N-十二烷酰基氨酸法提取外膜蛋白，优化其免疫剂量后免疫小鼠获得较强的免疫保护作用。上述试验方法操作简单、快速，对试剂、仪器设备要求低，但提取的产物浓度较低，不适用于大量生产。

2.2 Apx毒素表达纯化

溶血毒素（Apx）是决定App致病性强弱的关键因素，App能产生四种溶血毒素，即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。ApxⅠ、ApxⅡ具有溶血活性和细胞毒性，而ApxⅢ只有细胞毒性，ApxⅣ是新发现的一种Apx毒素，具有弱溶血活性，且体外不能分泌。Yoshihisa等采用亲和层析法提纯App溶血毒素（包括ApxⅠ和ApxⅡ），具有很高活性。但是Bohach认为大肠埃希菌α-溶血素属于RTX家族蛋白且与LPS形成大分子复合物，ApxⅠ及ApxⅡ均属于RTX家族成员，且 ApxⅠ（105ku）和 ApxⅡ（103ku）不能通过300ku的超滤膜，充分证明了ApxⅠ和ApxⅡ与LPS形成大分子复合物，因此提纯的ApxⅠ和ApxⅡ免疫猪只后观察的症状均为溶血毒素与LPS复合物产生的，而很小剂量的LPS就会引起猪只的多种临床症状，所以尽可能的分离溶血毒素-LPS复合物才会获得较安全的溶血毒素亚单位疫苗［16］。

研究表明，App在体内和体外不同条件下如温度、铁浓度、pH、渗透压、NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）浓度等所表达的毒力因子是不同的。培养液中NAD浓度对生物Ⅰ型App的生长有较大影响，低浓度NAD的培养条件能够使App分泌更多的毒素［17］，培养液中游离的Ca2＋可影响ApxⅠ的分泌，但不影响其活性，ApxⅡ、ApxⅢ的分泌不需要Ca2＋，但其活性却需Ca2＋作为辅助因子，因此为提高ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ毒素分泌及活性，马艳芳在培养App时在血清型3、7、10的LB培养液中加入0.02%NAD，在10型App扩大培养时在LB培养液中加入终浓度为1mmol／L的CaCl2，在提取、纯化ApxⅡ、ApxⅢ时，在Tris-HCl缓冲液中加入终浓度为1mmol／L的CaCl2。马艳芳对毒素纯化工艺流程进行优化，即将Sephadex D-200凝胶过滤层析、超滤管超滤同时进行，保证毒素活性不会降低，并提高了样品的纯度和产量。此方法简单快速，对设备要求低，纯化结果能够满足实验室进一步试验研究的需要［18］。

3 重组亚单位疫苗

由于Apx毒素的良好免疫原性，人们使用基因工程方法对App的毒力因子进行了重组表达，并对其进行免疫原性研究。Seah J N 等［19］将 ApxⅠA基因的N端部分编码区（40aa～380aa）在体外表达后免疫试验动物，免疫动物能抵抗至少3种血清型App的攻击。严克霞等［20］体外表达App的ApxⅡ的结构基因apxⅡA，其复性的重组毒素Ⅱ具有良好的免疫原性。王春来等［21］体外重组表达了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的5种主要毒力因子rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ、rApxⅣ和rOMP重组蛋白，以不同组分分组免疫小鼠，结果表明，rApxⅣ能够产生高滴度抗体并能产生很强的保护力。邵美丽等［22］体外重组表达了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的6种主要毒力因子rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ、rApxⅣ、rApfa和rOMP，以不同组分组合免疫小鼠，rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP组合免疫组可对小鼠产生高效的交叉保护力，增加免疫次数其抗体水平也会增加，而rApfa并没有提高免疫保护力，可能是因为rApfa的加入使rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP的抗体滴度下降所致。Shin M K等［23］将霍乱毒素B与ApxⅡA融合表达于一种植物草料种子中，饲喂后小鼠诱导其产生了针对Apx特异的免疫反应。

陈夏冰等［24］依据基因组杂交和转录谱分析重组表达了表面蛋白APJL-0126、HbnA和OmpW，免疫小鼠，可诱导产生高低度抗体，可作为PCP亚单位疫苗的添加组分，以提高免疫保护效力。Lee S H等［25］将App的ApxⅢ的N末端与猪肺炎支原体P97黏附素的R1和R2重复片段融合表达，称为蛋白Ap97，制成疫苗免疫动物获得很好的免疫效果。Seo K W 等［26］表达1型App的ApxⅡA的439-801的氨基酸片段，制成疫苗鼻内免疫小鼠，产生全身性的黏膜免疫反应，并可对5型App分泌的ApxⅠ、ApxⅡ产生交叉免疫保护。

大肠埃希菌表达系统是目前掌握最为成熟的的表达系统，其细胞繁殖快、产量高、IPTG诱导表达相对简单，成为重组蛋白最常用的表达系统。国内外学者多采用pGEX-6p-1或pET表达载体表达Apx毒素及OMP蛋白，OMP蛋白以可溶性形式表达；Apx毒素以包涵体形式表达，变性复性后进行纯化。大肠埃希菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强及适用范围广。但是原核蛋白表达系统表达的蛋白翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白几率较小。

4 讨论

亚单位疫苗最大优点是使用时不必检测患猪血清型，可以在全世界通用。Apx毒素是App的主要保护性抗原，与免疫保护作用密切相关，是疫苗的重要组分，但单一抗原组分的亚单位疫苗只能提供部分保护，且交叉免疫保护效果差。在PCP亚单位疫苗研究中，人们将Apx毒素做为多抗原亚单位疫苗的主成分，研究含多种抗原的亚单位疫苗的最适组合及发现App亚单位疫苗候选抗原将是我们的研究重点之一。常规亚单位疫苗抗原均是天然提取的App毒力因子，其提取纯化方法均为传统的物理、化学方法，成本高、价格昂贵，提取产物浓度较低，且App在体内和体外不同条件下所表达毒力因子是不同的。因此如何筛选合适的培养条件以利于毒力因子的高效表达，并简化生产过程，获取大量抗原，将成为亚单位疫苗努力的方向。基因工程方法获取抗原制备重组亚单位疫苗，生产过程简单，成本较低，产物纯度浓度均较高，且利于实现大规模生产，为亚单位疫苗抗原的获取提供了新思路。

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