猪瘟疫苗质量的替代检验方法研究进展

祖立闯，谢金文，2，沈志强，2＊，李 娇，唐 娜，2，王金良，2，苗立中，2，张 娜，王 艳，2，吴信明，2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起猪的以稽留高热、皮肤和黏膜出现大量出血点为主要特征一种高度接触性、致死性的传染病［1-3］，世界动物卫生组织将其列为A类烈性传染病［4］，我国农业部兽医局将其列为一类动物疫病，是目前危害我国养猪业的头号杀手，严重阻碍着我国养猪业的健康发展［5］。半个多世纪以来，我国一直采用以猪瘟兔化弱毒疫苗免疫接种为主的综合防控措施，使我国猪瘟的发生与流行得到了有效控制［6］。但近年来，我国猪瘟疫苗免疫失败的病例逐渐增多，导致免疫失败的原因很复杂，但疫苗质量达不到要求是其中一个重要原因［7-8］。而目前国标中采用的猪瘟疫苗效力检验、支原体检验、外源病毒检验的兔体定型热反应、培养法、荧光抗体检查法和致细胞病变检查法等质量检验方法均存在试验周期长、操作繁琐、敏感性较低等缺点，随着现代免疫学与分子生物学技术的快速发展，猪瘟疫苗质量检验新兴替代方法日臻完善。本文综述了猪瘟病毒的病毒含量测定、猪瘟疫苗效力检验、支原体检验、外源病毒检验等的免疫学与分子生物学检测新方法，以期为提高猪瘟疫苗的质量检验水平，保障猪瘟疫苗质量提供参考依据。

1 猪瘟病毒含量测定及疫苗效力检验替代方法

由于猪瘟病毒不能产生细胞病变，因此国标中对病毒含量或疫苗效力检验主要依靠兔体定型热反应方法，该方法试验成本较高、操作繁琐、试验周期较长，且受试验动物的个体差异、环境因素等多方面原因影响，检测结果不是十分准确。因此，建立新型实用、标准化的疫苗效力检验替代方法势在必行。荧光定量RT-PCR方法可以对病毒含量进行实时监测，具有特异、敏感、快速、高通量和实时等优点［9-10］，为猪瘟病毒的病毒含量测定及猪瘟疫苗效力检验提供了新的技术支持。ELISA方法与胶体金方法检测快速、操作简单、高通量，且可实现对病毒的定量或半定量［11-12］，可应用于猪瘟病毒的病毒含量测定及猪瘟疫苗的效力检验。

1.1 荧光定量RT-PCR方法

李安等［13］建立了一种能够快速定量检测猪瘟病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法，该方法可以对猪瘟脾淋苗和细胞苗进行定量检测，102拷贝／μL的总RNA即能得到特异性扩增，并与兔体定型热反应具有良好的相关性。葛叶等［14］采用荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热反应对5份猪瘟细胞苗和6份半成品样品进行检测，两种检测方法存在极高的正相关性。陈锴等［15］应用荧光定量RT-PCR方法和兔体定型热反应对4个厂家17个批次的34份猪瘟疫苗进行效力检验，二者表现出了极高的相关性，得出荧光定量RT-PCR方法可以用于猪瘟疫苗效力检验。实时荧光定量RTPCR检测方法可以替代传统的兔体定型热试验用于疫苗生产过程中的半成品抗原效价监测，指导疫苗配制，也可以作为成品疫苗效力测定的一种参考方法，为猪瘟疫苗效力检验提供敏感、准确和快速的替代检验方法。但由于该方法高度敏感，导致难以确定疫苗半成品检验和成品检验合格的最低标准基准值，因此难以成为国家法定的质量检验标准方法。尽管如此，该方法仍然可作为实验室与猪瘟疫苗生产企业猪瘟疫苗质量检验的参考方法应用于猪瘟疫苗的生产检验等。

1.2 ELISA方法

唐红慧等［16］应用ELISA试剂盒和兔体定型热反应对24份猪瘟疫苗半成品和21份成品疫苗进行病毒抗原含量测定，二种检测方法的检测结果符合率达95.8%，表明ELISA方法能够用于猪瘟细胞苗的半成品与成品的病毒含量测定，但该方法无法区分猪瘟病毒抗原与牛病毒性腹泻病毒抗原。蒋卉等［17］采用IDEXX商品化的猪瘟抗体ELISA检测试剂盒对注射猪瘟病毒的家兔血清样品进行抗体检测，并且与体温反应结果进行比较分析，家兔体温反应与ELISA抗体检测结果具有较高的正相关性，两者符合率为95.83%。李娇等［18］以纯化的猪瘟病毒重组E2蛋白为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗，组装了检测猪瘟病毒抗体的PPA-ELISA诊断试剂盒，因SPA能与猪、兔等哺乳动物血清IgG的Fc段结合，使该试剂盒可应用猪瘟疫苗免疫后的猪、兔血清抗体效价检测。虽然ELISA抗体检测方法依然采用家兔进行效力检验，但省去了传统方法每6h家兔测温1次的工作，大大减轻疫苗检验工作的强度，避免了传统方法中因家兔质量和环境等因素对体温检测结果的影响。ELISA方法具有操作简便、快速的特点，其结果更具有良好的重复性和稳定性，为猪瘟疫苗的质量检验提供了一种可靠和稳定的方法。

1.3 胶体金检测方法

免疫胶体金技术具有简便、快速、无污染、不需特殊仪器、特异性强、敏感性高、结果判断直观等优点，在猪瘟的快速诊断与抗体效价检测中得到了广泛应用。陈龙宾等［19］、李华玮等［20］均建立了检测猪瘟病毒的胶体金试纸条，试纸条不需要任何试验仪器，将待测样品加入检测卡的加样孔内，室温下静置10min～20min，就可以准确地检测出被检样品是否带有猪瘟抗原，同时还可以通过检测线颜色的深浅判定病毒含量的多少。但目前，胶体金检测方法仅能够进行猪瘟病毒含量及抗体效价的定性检测，以及根据颜色深浅进行半定量检测，还无法达到荧光定量RT-PCR方法和ELISA方法的定量分析，相信随着免疫技术、标记技术的日趋成熟、分析仪等定量检测仪器的开发与应用，免疫胶体金技术在猪瘟病毒含量测定与猪瘟抗体效价检测等方面将会有更为广阔的应用前景。

2 支原体检验替代方法

支原体污染是动物疫苗特别是动物细胞苗研制过程中的一个十分棘手的问题，生产生物制品的细胞一旦受到污染，就会影响病毒的繁殖，导致生物制品的品质下降或废弃，给动物疫苗生产企业带来不小的经济损失，因此建立支原体的检测方法非常重要。我国兽药典中规定对支原体的检测采用直接培养法，该方法通过观察液体培养基的颜色变化和显微镜下的菌落形态就可得出结果，是较直接的检测方法，其缺点是培养时间长，需29d才能完成，操作相对繁琐。而PCR技术具有敏感、特异、快速、准确等优点，为兽用疫苗中支原体的检验提供了新的方法［21］。张娜等［22］根据16SrRNA支原体种属特异性区域设计合成引物，优化PCR反应条件与体系，建立了检测兽用生物制品中支原体污染的PCR方法，并应用该PCR方法和传统培养法同步检测血清、疫苗、细胞株等样品共计224份，PCR方法检测出阳性25份，阳性率为11.2%，传统培养法检出阳性13份，阳性率为5.8%，PCR方法比传统培养法灵敏、特异，且检测时间大大缩短。蒙业军［23］建立了检测动物疫苗支原体的巢式PCR方法，该方法敏感性更高，且特异性强、重复性好、结果准确可靠，可广泛用于细胞库、病毒种子库、动物疫苗细胞培养物中的支原体污染监测。

3 外源病毒检验替代方法

猪瘟细胞苗在生产过程中要用牛血清、胰酶、牛睾丸等原辅材料，这些材料中若带有牛病毒性腹泻病 毒 （Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVDV）、猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）等，会造成猪瘟细胞苗污染外源病毒。我国兽药典要求的猪瘟疫苗外源病毒检验方法为荧光抗体检查法和致细胞病变检查法，2种检测方法耗时较长、费时费力，操作复杂，且BVDV-2不产生细胞病变，难以满足快速检验的需要。另外，BVDV与CSFV存在血清学上的交叉反应，故常规血清学诊断方法很难将其鉴别诊断。随着分子生物学技术的日臻进步，基于BVDV与CSFV核酸序列差异的分子生物学方法不断发展和完善，为猪瘟疫苗的外源病毒检验提供了技术支持。

3.1 RT-PCR方法

祖立闯等［24］建立了检测BVDV的套式RTPCR方法，该方法重复性好、特异性强、敏感性高，可以准确快速检测出极低含量的BVDV，可用于动物与疫苗生物制品原辅料中BVDV的快速检测。叶兆美［25］采用PCR方法对19份猪瘟疫苗和蓝耳病疫苗样品进行BVDV和PCV-2抗原的检测，BVDV污染率达10.53%。曹玉美等［26］采用RTPCR方法对国内6个厂家生产的10个批号猪瘟疫苗进行了监测，结果表明有4个厂家生产的疫苗BVDV核酸检测阳性，有7批次疫苗检出BVDV核酸。陶洁等［27］将上海猪场送检的1份猪瘟疫苗接种于MDBK细胞，盲传15代后仍无致细胞病变效应，但通过RT-PCR和序列鉴定为BVDV-2型毒株，表明该猪瘟疫苗中的确污染BVDV。以上研究结果表明，我国猪瘟弱毒活疫苗中存在严重的BVDV、PCV-2等外源病毒污染现象，而RT-PCR检测方法敏感性高、特异性强、操作简单、检测快速，在动物猪瘟疫苗的外源病毒检验中将具有广阔的应用前景。

3.2 荧光定量RT-PCR方法

Zhang X J等［28］建立了可检测区分猪瘟野毒、猪瘟疫苗毒和BVDV-Ⅰ的三重实时荧光定量RTPCR方法，该方法检测猪瘟野毒、猪瘟疫苗毒和BVDV-Ⅰ的下限分别为4.5、10、3.2TCID50，提供了一个鉴别猪瘟野毒、猪瘟疫苗毒和BVDV-Ⅰ的方法。陈其兵等［29］建立的快速检测BVDV的实时荧光定量RT-PCR方法，检测胎牛血清和猪瘟细胞苗半成品共计20份样品，结果BVDV阳性6份，阳性率达30%（6／20）。韩文等［30］对278批次 HCLV 疫苗进行BVDV污染情况检测，结果有42批（15.1%）疫苗存在BVDV污染。实时荧光定量RTPCR检测方法敏感、特异、快速、准确，可用于牛血清及猪瘟疫苗等生物制品中BVDV等外源病毒的快速定量检测。沈志强等［31］建立了BVDV SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR检测方法，并应用该方法检测了山东绿都生物科技有限公司的猪瘟脾淋疫苗半成品样品125份，疫苗成品样品86份，未检出BVDV，为疫苗的纯净性与安全性提供了技术保障。

4 结语

疫苗效价的高低是判定疫苗合格与否的关键指标，而无外源病毒和支原体污染是保证疫苗效价及安全的首要因素。及时、准确、快速的检测猪瘟疫苗及其半成品、原辅材料中的纯净性，以及准确的定量监测猪瘟病毒含量是生产合格疫苗的有效保证。尽管目前这些新型的替代检验方法尚未上升成为国家标准，但在猪瘟疫苗生产企业的生产与检验中也充分体现出了重要的关键的检验参考价值，相信随着这些分子生物学和免疫学技术检验方法的进一步完善与标准化及广泛应用，猪瘟疫苗的质量检验方法必将会不断完善，将会走进每一个猪瘟疫苗生产企业，全面提高猪瘟疫苗质量检验水平，在猪瘟疫苗质量检验实践中不断总结经验，凝聚质量检验标准共识，上升为国家法定标准，从而促进我国猪瘟疫苗与猪瘟防控事业的稳定、健康发展。

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