绵羊肺腺瘤病毒致瘤机制研究进展

刘 畅，敖威华，李 磊，于立新，么宏强，周建华，马学恩

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；3.安徽科技学院动物科学学院，安徽凤阳 233100；4.内蒙古出入境检验检疫局技术中心，内蒙古呼和浩特 010020；5.哈药集团生物疫苗有限公司，黑龙江哈尔滨 150001）

绵羊肺腺瘤（Ovine pulmonary adenomatosis，OPA）的病原是绵羊肺腺瘤病毒 （OPAV）。OPAV是典型的β逆转录病毒，其基因组成仅包含逆转录病毒必要的结构基因gag、pro、pol和env，同时在病毒基因的两端还各包含一个病毒复制不可缺少的非编码区，即长末端重复序列（long terminal repeat，LTR）。OPA多发生于绵羊，在欧洲、非洲、美洲及亚洲都有流行，几乎所有养羊业发达的国家和地区都有该病的存在，对于养羊业的发展，特别是种羊业具有重大影响，世界动物卫生组织（OIE）将该病列为必须通报的动物疫病。本文就当前OPAV的转录特异性、受体及其囊膜蛋白等相关致瘤机制的研究进行综述。

1 OPAV转录特异性

OPAV在逆转录病毒中具有独特的性质，能够恶性转化肺Ⅱ型上皮细胞和无纤毛细支气管细胞（克拉拉细胞，Clara cells）。有研究表明，在由肺Ⅱ型上皮细胞和克拉拉细胞衍生的细胞系（MLE－15和mtCC1－2）中，OPAV LTR具有较强的转录活性［1－2］。单独表达 OPAV 囊膜蛋白（Env）可诱导鼠成纤维细胞系NIH 3T3转化。LTR在某些逆转录病毒转化细胞中起重要作用，但OPAV的LTR却没有该诱导转化能力［3］。OPAV LTR的U3序列中包含2个与肺特异基因表达有关的转录因子——肝细胞胞核因子3（HNF－3／Fox－a2）结合位点。在NIH 3T3细胞中表达的外源 HNF－3能够增强OPAV LTR的转录活性，提示LTR的转录特异性决定了 OPAV 对肺组织的趋向性［1－2］。

在OPAV LTR中与CATT／增强子结合蛋白（CATT／enhane linding protein，C／EBP）和转录因子核因子（nuclear factor1，NF－1）亚型相结合的2个额外基序显示出其对于LTR活性来说是非常重要的［2］。缺失突变 OPAV LTR 与转录因子C／EBP﹑HNF－3β的结合位点使得该LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内的启动子活性下降约60%～70%，说明这两个转录因子的结合位点对OPAV LTR在肺Ⅱ型上皮细胞内的特殊嗜性具有重要作用［4］。而OPAV LTR中对宿主转录因子Gfi－Ⅰ的结合位点对该LTR在肺Ⅱ型上皮细胞内的启动子活性却几乎没有影响［4］。

2 OPAV受体

研究表明，OPAV 受体为 Hyal－2（hyaluronoglucosaminidase 2）。Hyal－2蛋白通过糖基磷脂酰肌醇（glyocsyl phosphatidyl inositol，GPI）与细胞膜相连，是一种GPI锚定蛋白。Hyal－2具有透明质酸酶活性，可通过裂解胞膜透明质酸影响OPAV的致瘤作用。由于Hyal－2为GPI锚定蛋白，因此还可通过GPI对细胞信号转导产生影响。此外，该蛋白还具有一些目前尚未明确的生物学功能（例如促进绵羊胎盘形态发生）［5］。同时，Hyal－2还是地方性鼻内肿瘤病毒（enzootic nasal tumorvirus，ENTV）和内源性OPAV（enOPAV）的受体。OPAV Env的表面蛋白亚基（SU）能够与绵羊 Hyal－2相结合，其中su基因的238bp～867bp域对这种结合是必须的［6］。

OPAV受体Hyal－2蛋白结合于生长因子Stk／RON受体，形成Hyal2－RON复合体，具有低酪氨酸激酶受体家族成员（recepteur d＇origine nantais，RON）激酶活性。当存在OPAV Env时，Env能够替换Hyal－2而释放出RON，结果增加了激酶的活性。这些细胞RON活化后便激活了PI3K／Akt和MAPK这两条通路［7］。虽然OPAV Env能够转化啮齿动物成纤维细胞，但是OPAV Env的SU亚基却不能与鼠源Hyal－2受体相结合。并且，过表达鼠Hyal－2对OPAV Env转化NIH 3T3细胞没有影响。另外，Stk／RON在成纤维细胞中不表达。然而，在表达人Hyal－2和绵羊Hyal－2的NIH 3T3细胞中，OPAV Env的转化能力却受到了明显的抑制，这可能是通过促进Env的降解而起作用的［3，8］。

3 OPAV囊膜蛋白的致瘤作用

3.1 OPAV的env基因是一个癌基因

为研究OPAV的促肿瘤形成机制，曾有人尝试证明OPAV可能携带癌基因，并通过研究OPAV基因组能否从形态学上转化体外培养的细胞来证明该假说。巨细胞病毒（cytomegaovirus，CMV）启动子调控的OPAV21表达质粒可用于检测OPAV基因组的转化可能性。在NIH 3T3细胞中，OPAV LTR的转录活性很低，而将OPAV21DNA转染进入该细胞后，发现这些细胞呈转化聚积表现，并且该聚积区域内检测出 OPAV 的 DNA［9］。这表明OPAV包含可能转化NIH 3T3细胞的基因，同时这也强烈地提示OPAV携带有致癌基因。后期的试验证明了OPAV env基因单独表达对于诱导转化NIH 3T3细胞是必须和充分的［9］。OPAV Env的致癌能力在体内也已被证明过了［10］。将OPAV Env第501位亮氨酸／缬氨酸是OPAV在pH5.0下进行膜融合及感染所必须的［11］。

OPAV Env的穿膜蛋白亚基横跨病毒囊膜脂质双分子层，包含有一个长度为44个氨基酸的C末端区域。Env很有可能在感染或转化细胞中起到重要的作用。Env的胞质尾区包含有YRNM序列，即“YXXM”基序；如果其中的酪氨酸是磷酸化的，则该序列可能的作用是PI3K／p85调节亚基的一个结合位点［12］。

3.2 OPAV囊膜蛋白各区域在转化中的作用

OPAV Env在不同培养条件下、对不同细胞系的转化作用可能有所不同［13］。env基因经位点删除和置换突变后进行转化试验，结果显示TM的胞质C末端区域对于OPAV Env转化能力是必不可少的［14］。TM胞质尾部中的“YXXM”基序是很保守的，但在非转化型的enOPAV中却是缺失的。这与OPAV Env激活质膜PI3K的形式相一致，被激活的PI3K对Akt以及下游信号途径发出指令，即PI3K／Akt通路密切参与细胞增殖。

将“YXXM”基序中的酪氨酸残基点突变为苯丙氨酸或天冬氨酸后，Env失去了转化NIH 3T3细胞的能力［14］。不过在其他细胞系中，这种转化抑制却不是绝对的。同样地，“YXXM”基序中的甲硫氨酸残基（M）突变也可以导致其OPAV Env失去转化NIH 3T3细胞的能力，而在其他细胞系中这种效应也不是一定的［14］。虽然 TM 的胞质尾区对于OPAV转化是重要的，Env其他区域也有可能同样参与了OPAV的转化。有研究表明，在OPAV Env诱导NIH 3T3细胞转化并激活Akt的过程中，其TM亚基起到了主要作用，并且TM亚基还具有单独诱导NIH 3T3细胞转化的能力［3］。此外，在SU糖蛋白中小片段的缺失或插入也可以抑制OPAV Env转化NIH 3T3和208F成纤维细胞，SU的氨基末端区域有利于转化，而C－末端部分是不重要的［15］。OPAV Env的SU亚基具有调节其局部结构的功能，通过受体介导由低pH激活的膜融合［16］。因此，在OPAV Env诱导转化过程中，细胞转化信号可能是由SU和TM亚基分别提供的［3］。

3.3 活化的Akt是OPAV囊膜蛋白介导转化的重要标志

在OPAV转化的几个细胞系中都能够检测到含量较高的磷酸化 Akt［3，9］，同样的在 OPA肿瘤组织中也可以检测到［12］。此外，细胞感染OPAV后，PI3K－Akt通路的激活剂也能够使细胞Akt信号通路发生调节异常。采用PI3K的抑制剂——渥曼青霉素和LY294002处理细胞，结果OPAV诱导Akt磷酸化的能力被高度抑制［9，12］，这显示了在这些细胞中发生了PI3K依赖性的Akt激活。OPAV Env的TM胞浆尾部“YXXM”基序的Y590磷酸化且该基序的酪氨酸残基突变，这些都不能完全废除其转化这些细胞系的能力［12，15］。尽管 OPAV Env转化能力有所降低，但是OPAV“YXXM”基序突变却也不能完全阻止 Akt磷酸化［12，15］。这或许是 OPAV Env通过尚未明确的细胞受体或由OPAV Env所触发的其他信号通道间接地激活了PI3K／Akt信号通路。此外，OPAV能够诱导缺乏PI3K／p85亚基的NIH 3T3细胞发生转化，并且在转化细胞中Akt被激活，这说明PI3K不是OPAV诱导细胞发生转化所必需的［12］。因此，研究者普遍认为，无论是否依赖PI3K，激活Akt是OPAV Env介导细胞发生转化的分子标志［15］。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的抑制剂雷帕霉素（rapamycin，RAPA），可以局部抑制Env的转化率，这显示出mTOR与OPAV Env诱导转化 NIH 3T3细胞有关［12］。

4 enOPAV干扰外源性OPAV复制

4.1 内外源性OPAV的结构差异

在绵羊的基因组中存在与OPAV前病毒基因组高度相关的多个内源性拷贝［17－18］，因此在研究OPAV致瘤机制时必须将enOPAV和外源性OPAV（exOPAV）的基因序列进行区别［19］。exOPAV区别于enOPAV的典型分子特征，包括其ex－OPAV gag基因中的ScaⅠ酶切位点，核衣壳蛋白区2个保守的可形成锌指结构的“CCHC”基序和env基因编码的TM区胞浆尾部包含保守的特异性“YXXM”基序［20－22］。

4.2 内源性OPAV干扰外源性OPAV复制的机制

enOPAV的env基因序列虽然不会导致肿瘤，但是值得注意的是enOPAV表达的蛋白可以有效地阻止感染exOPAV。enOPAV表达的Env与Hyal－2结合后可以有效的阻止机体感染exOPAV，其主要原理为受体干扰［17－18］。另外一种enOPAV干扰机体感染exOPAV的方式是通过内源性Gag蛋白阻止病毒的组装以及病毒的释放［18］。enOPAV能够干扰exOPAV的生命周期，从而导致在高表达enOPAV的组织（雌性生殖道）中exOPAV失去了致病能力。因此，这很可能使得exOPAV在不表达enOPAV的组织（例如呼吸道）上存在的组织趋向性。

5 其他

5.1 OPAV致瘤机制与肿瘤相关基因突变的关系

肿瘤的发展过程受多个基因、多种细胞因子调控。由致癌基因和抑癌基因突变积累造成恶性肿瘤的发病过程常与细胞凋亡、细胞增殖失控有关，其中涉及的突变基因包括癌基因、抑癌基因及一些修饰基因。

有研究表明，OPAV的致瘤机制与肿瘤相关基因突变之间存在一定的联系［23］。在OPA自然患病绵羊肺脏基因组DNA中，检测到kras基因第1外显子核苷酸突变位点为35G→T（第35位核苷酸由G突变为T），编码的氨基酸位于第12密码子：12G→V，突变率达20%；一例阳性样品p53基因第7外显子检测出突变，核苷酸突变位点为：825T→C，但编码的氨基酸未发生突变，依然是C即半胱氨酸，突变率达10%［23］。然而，OPAV Env及其亚基诱导NIH 3T3细胞转化的分子机制却可能与肿瘤相关基因突变无关［24］。

5.2 OPAV致瘤机制与凋亡的关系

与OPAV Env转化作用有关的信号通路中最重要的就是PI3K／Akt信号通路，该通路被激活后能够抑制细胞凋亡和细胞周期G1期到S期的过渡，促进细胞生存和增殖［12］。研究表明，OPAV Env诱导转化信号通路PI3K－Akt的激活产物—活化的Akt能够磷酸化一些与凋亡有关的蛋白，主要包括叉头框（Fox）转录因子、caspase－9以及促凋亡 Bcl－2家族成员BAD［24］。另外，活化的Akt还能够激活mTOR，活化的mTOR通过磷酸化核糖体S6激酶（ribosomal S6kinase，p70S6K）调节细胞周期，从而影响细胞增殖［24］。

6 小结

OPA广泛分布于内蒙古的锡林郭勒盟、鄂尔多斯市、呼和浩特市、呼伦贝尔市等地以及我国许多养羊省区，对种羊业危害严重。近年来国际上对OPAV致瘤机制的认识逐渐取得了一些共识，概括地讲，过度的细胞增殖信号积累引起肺脏具有分泌作用的上皮细胞异常增生和发生恶变，最终引发肿瘤。近年来的研究表明，在OPA发病绵羊的肺脏组织中，还能够检测到过表达的角蛋白19（cytokerarin 19，CK19）和醛缩酶 A［25］。但在这一学说中，仍有许多重要的基础问题尚未完全清楚（例如磷酸化Akt具体的激活机制），需要进一步研究。同时，OPA在组织病理学变化、超微变化等方面与人细支气管肺泡癌（bronchiolo－alveolar carcinoma，BAC）极为相似［12］，故OPA也可作为研究病毒与BAC二者间关系的理想动物模型。因此，深入探究OPAV的致瘤机制对于确定BAC相应的防控靶点、建立动物模型，具有重要的理论意义和潜在应用价值。

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