源性成分鉴别检测技术研究进展

李丽娟，袁晓龙（.贵州工程应用技术学院毕节试验区研究院，贵州毕节55700；.华南农业大学动物科学学院，广东广州5064）



源性成分鉴别检测技术研究进展

李丽娟1，袁晓龙2
（1.贵州工程应用技术学院毕节试验区研究院，贵州毕节551700；2.华南农业大学动物科学学院，广东广州510642）

摘 要：自疯牛病和禽流感等疾病暴发以来，世界各国将食品安全、饲料安全视为涉及国家公共安全的重大问题。随着生活水平的提高，人们越来越注重生活质量，但是在生产实践中，常有以假乱真和以次充好的现象，源性成分的检测成为判别的标准已涉及到各行各业。论文对源性成分检测的起源、应用和常用的方法做了综述，以期为商品真伪鉴别、品质鉴定、防止动物疫病病原体传播等提供参考。

关键词：源性成分；物种鉴别；检测技术

1986年，在英国的牛肉骨粉中首次检测到疯牛病病原体，动物源性饲料存在危害人类健康的潜在威胁，导致许多国家禁止或严格限制以动物源性蛋白作为动物饲料蛋白供体［1］。在经济、交通和科技高速发展的今天，人们对食物安全越来越重视，迫切需要对食品、饮料、饲料等物品贴上准确和严格的标签。源性成分检测已成为当前鉴别物品类别最主要的方法［2］。源性成分检测是指通过物理、化学、免疫学和分子生物学等方法，对食品、饲料、衣服等物品的成分进行种类来源检测和鉴别［3］。进行动物源性成分检测主要有3个原因：①含有疯牛病、羊痒病和禽流感等可传染性疫病的病原体饲料严重威胁着畜牧养殖，通过食物链也威胁人类的健康；②不同地区的人们有不同的宗教信仰和饮食习惯，对进食何种肉制品有不同的需求，比如穆斯林地区的人们不吃猪肉，印度地区的人们不吃牛肉等，需要对食品进行源性检测，准确标明食品成分；③一些不法制造商为了牟取不正当利益，以低价值的物品充当高价值的物品，欺骗消费者，进行不公平交易［3］。源性成分检测有很多现实的意义，可以鉴别肉制品的种别、性别、年龄和地理区域等，判定其是否是有机肉类制品；也可以鉴别肉制品经过何种加工处理，鉴定肉制品是冷鲜肉还是冷冻肉，是烘烤肉还是烹饪肉；亦可以鉴定肉制品中是否含有添加剂及是否是注水肉［4］。源性成分的检测已涉及到各行各业，与人们的生活息息相关，检测方法也从最初的耗时、复杂、单一和准确性低的检测技术，发展为多种多样、方便操作和准确性高的检测方法。

1　源性成分检测方法

早期的源性成分检测方法主要是物理和化学的鉴别方法，依据物品的物理、组织学等特点和化学成分进行鉴定。20世纪70年代，主要为基于蛋白质水平的检测方法，包括蛋白质电泳、液相色谱和免疫化学法；1983年随着PCR技术的出现，发展了很多基于DNA序列的分子生物学检测方法，有随即扩增多态性DNA法（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）、物种特异引物法（species-specific primers）、限制性内切酶片段长度多态性法（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和实时荧光定量PCR法（real-time PCR）。随着生命科学技术的发展，也发展了基于代谢组学、蛋白组学和基因组学的源性成分检测方法。

1.1早期动物源性成分检测方法

早期的动物源性成分检测方法包括物理和化学的鉴别方法。物理鉴别方法是通过人的感觉器官对产品的真伪及质量进行评价和判断，主要依据物品的物理和解剖特点，包括肌肉粗细、颜色、气味、椎骨数和其他组织学特点等判断。例如利用显微镜根据肌纤维的长度、大小和骨质密度的不同，鉴别物种源性。光镜检测也是现在欧盟官方检测加工性动物源性蛋白的唯一方法［5］。这种检测方法具有简便、直观、判决快、成本低和实用等特点，能及时检验出食品的真伪和优劣，以及食品质量有无异常。但食品一旦经过加工处理，检验的难度将增加以及准确性将大大降低。同时对检验人员经验要求较高，而且

检验人员的主观性差异容易对检测结果产生影响。

化学鉴别方法主要包括色谱鉴别法和光谱鉴别法，色谱鉴别法是通过气相、液相等色谱进行源性分析。色谱的图谱相对复杂，无法检测混合样本，且样品制备比较繁琐，检测仪器相对较贵，使得色谱法在源性成分检测上的应用受到限制；光谱鉴别法是通过光谱照射，检测其吸光度进行分析。常用的光谱有近红外光谱和中红外光谱。这些光谱可以单独使用，也可以联合使用。由于近红外光谱分析技术具有速度快、重复性好、成本低和测量方便等优点，被越来越多地被应用于食物、石油化工、制药等领域。例如Boselli E等［6］利用蒸发光散射和串联质谱检测猪肉的磷脂分子，鉴别了猪肉的物种源性。

1.2基于蛋白质的鉴别方法

20世纪70年代，源性检测技术发展了很多基于蛋白质的检验方法，包括蛋白质电泳法、层析法和免疫化学法［2］。电泳法是指在电泳介质存在的条件下，不同的蛋白质因为结构和带电量的不同，有不同的迁移速度，从而鉴别物种源性。常用的电泳介质是聚丙烯酰胺凝胶电泳和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。层析法是利用流动的相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离效果。免疫化学方法是依据抗原和抗体特异性结合的原理，最常用的是酶联免疫吸附试验（ELISA）。Chen Y等［7］用ELISA鉴别三明治中是否含有鱼的物种源性物质，为对鱼蛋白过敏的人提供有效的参考。但这种方法有很大的局限性，用兔抗猪的血清球蛋白和兔抗羊的血清球蛋白通过ELISA的方法，鉴别牛肉中混杂的猪肉和羊肉，在没有烹饪的条件下，ELISA能鉴别牛肉中含猪肉和羊肉的灵敏度为5%，烹饪后ELISA不能鉴别出牛肉中混合的猪肉，并且羊肉的鉴别信号下降70%～74%。

1.3基于DNA序列的分子生物学方法

源性检测方法中无论物理方法和化学方法，亦或者是基于蛋白质特性的检测方法，都存在很大的局限性，物理方法和化学方法需要有长期实践积累的经验，并且结果有很大成分的人为主观因素。基于蛋白质的源性检测方法也有很大的局限性，比如高温加热肉制品后，这类方法的准确性和可靠性变得很低。聚合酶链式反应（PCR）技术面世后，源性检测方法有了里程碑意义的突破，基于PCR源性检测的方法操作方便，结果可靠性高。

因为不同物种的基因组不同，依据物种的特异序列，可以用引物经过PCR扩增特异的产物来鉴别物种源性，比如用PCR的方法鉴别了肉食杆菌的不同种属，鉴别了肉制品中是否含有某种致病菌，也检测了海鱼产品中是否含有葡萄球菌［8］。RAPD方法是通过提取样品DNA后，设计特异引物，随机的扩增DNA片段，形成多个片段纹路，每个物种有自己独特的DNA片段多态性，依此来区分物种源性。Saez R等［9］利用这种方法，快速简便的检测了牛肉、猪肉、羊肉和火鸡肉产品的物种源性。物种特异引物的方法是对物种间特异的DNA序列，设计特异的引物，扩增出特异的片段来鉴别物种源性［10］。RFLP的方法是针对物种间保守或非保守的序列设计引物，扩增出DNA片段，用不同的限制内切酶酶切扩增片段得到不同的产物，从而区别物种源性［11］。Murugaiah C等［12］针对牛、猪、水牛、鹌鹑、鸡、山羊和兔的线粒体cyt b基因设计引物，扩增出359bp的片段，然后用不同的限制性内切酶酶切扩增产物，根据酶切产物来区分这6个物种的动物源性成分。Mahajan M V等［13］针对线粒体的12S rRNA基因设计引物扩增出456bp的片段，用AluI、HhaI、BapTI和ApoI限制性内切酶酶切扩增的片段，得到不同的酶切产物片段来鉴别物种源性。real-time PCR的方法也是基于DNA上稳定的基因序列设计定量引物，不仅能鉴别物种源性，也能一定程度上鉴别掺杂量。Kesmen Z等［14］针对线粒体的ND2、ND5和ATP6-8基因设计引物，利用real-time PCR的方法鉴别出驴、猪和马的物种源性，灵敏度高达0.1pg。Soares S等［15］针对线粒体的cyt b和12SrRNA基因序列设计定量引物，产物大小分别为149bp和183bp，可以高灵敏度的区分并定量家禽肉中掺杂了多少猪肉。

用DNA作为动物源性成分检测的标记比较稳定并且特异性比较高，其以便捷经济的特点被广泛的运用到各个领域的检测。选择作为标记的DNA序列，有的基于核DNA序列，也有的基于mtDNA、rRNA和mRNA序列，选择作为标记的核DNA序列多是一些加热前后稳定的基因序列，比如猪的leptin基因［16］和牛的β-actin基因［17］等，选择作为标记的mtDNA多是D-loop区域、cyt b基因、COI基因、16SrRNA和12SrRNA等［18］。对猪线粒体的D-loop区域设计引物，无论是风干的猪肉还是烹饪的猪肉提取的DNA都能扩增出531bp的片段，这对引物在牛肉、羊肉和鸡肉提取的DNA中没有扩增产物，并且利用AvaⅡ限制性内切酶酶切扩增的产物，能区分猪肉是否是野猪肉。Dalmasson A等［19］针对线粒体的12SrRNA和16SrRNA设计

引物，对反刍动物、家禽、鱼类和猪的基因组DNA样品分别扩增出102bp～104bp、183bp、220bp～230bp和290bp的产物，鉴别了样品的源性成分，并且检测灵敏度为0.000 4%。Lin C C等［20］利用线粒体COI基因设计引物，能够检测混合样品中含有几种动物源性物质。

基于DNA序列的源性检测方法，有的研究表明加热样品后对检测结果没有影响，Ulca P等［21］利用PCR的方法对掺杂了猪肉的牛肉、鸡肉和火鸡肉，进行源性检测，分别在常温和200℃下处理20min，发现检测灵敏度为0.1%。有研究结果表明温度和加热的时间会影响检测的结果，Sakalar E等［22］对牛、猪和鸡的线粒体设计引物，产物长度分别为374、290、240bp，然后对牛肉、猪肉和鸡肉在200℃下烘烤10、20、30、40、50min，在30、60、90、120、150、180、210℃烘烤30min，在99℃下蒸煮10、30、60、90、120、150、180、210min，通过RT-PCR的方法定量，发现目标序列的拷贝数受温度和时间的影响。

源性成分检测技术也随着生命科学技术的发展而发展，特别是新一代高通量测序技术大大减少了基因组测序的成本和时间，通过组学的分析获得生物的遗传多样性和分子生物学信息，为物种源性的鉴别提高了更为严密可高的检测技术。例如2014 年Smolina I等［29］利用新一代测序技术分析了飞马哲水蚤和北极哲水蚤的基因组和转录组，发现了12个缺失插入标记，从分子水平上非常精确的鉴别了哲水蚤。

2　源性成分检测的应用

随着源性成分检测技术的不断发展，源性成分的检测已被应用到各个行业，技术不断提高，范围不断扩大。随着研究的深入，在畜牧养殖业中已对鸡、鸭、鹅、鹧鸪、火鸡、鹌鹑、马、驴、鹿、猫、狗、鱼以及禽类等物种做了鉴别检测方法的各种研究。自疯牛病和禽流感暴发以来，世界各国将食品安全、饲料安全视为涉及国家公共安全的问题，加强了监控畜禽类肉食品及其饲料的源性产品安全监督，因而在畜牧养殖业动物源性成分的检测技术显得尤为需要。邵碧英等［24］对动物产品及饲料中牛源和羊源性成分PCR检测方法进行了优化，使牛源性成分的最低检测限可达10μg/g；赵冉等［25］用PCR检测方法，能特异地鉴别检测出牛、山羊和绵羊的源性成分，且敏感性比现行国标PCR法高100倍；陈永锋［26］用双重荧光PCR检测方法，检测到饲料及动物性食品中的山羊和绵羊源性成分比国标法（GB/T20190-2006）的灵敏性高100倍。

食品餐饮业的掺杂涉假已渗入到农贸市场、餐饮饭馆，乃至深受消费者信赖的知名超市。在牛、羊、鹿等高价肉制品中掺杂猪、鸭等低价肉原料；在牛奶中添加三聚氰胺提高含氮量，或用牛奶冒充羊奶。名贵中药材的数量往往稀有，价格昂贵，市场上假冒伪劣产品较多，真伪难。不法分子使用马皮、牛皮、猪皮、病死动物之皮等来取代驴皮进行熬制，损害了消费者的利益。学者们也初步建立了一些鉴别检测的方法［27-31］，还需要进行较深入的研究，为消费者建立公平放心的交易和消费平台。

3　展望

动植物源性成分广泛存在于食品、饲料、药品、保健品和服装等领域，与我们的生活密切相关。各种动物疫病的暴发和商品中掺假现象层出不穷，源性成分检测技术已成为商品真伪鉴别和品质鉴定等工艺中迫切需要的技术。但源性检测技术各有其优缺点，在选择何种检测方法时，需要考虑检测目的、样品性质、样品数量、可用的仪器和设备及费用等。对源性成分检测进行较深入的研究，对于防止商品欺诈、动物疫病病原体传播和宗教饮食禁忌引发的民族矛盾等方面都有着十分重要的意义。挖掘高灵敏度和高特异性的源性成分检测技术也已成为摆在科研工作者面前的重大课题。

参考文献：

［1］ Rogberg Munoz A，Posik D M，Ripoli M V，et al.Recent patents for detecting the species of origin in animal feedstuff，and raw and processed meat products［J］.Recent Pat Food Nutr Agri，2013，5（1）：3-8.

［2］ Liu G，He C，Zhang H.Identification and characterization of dermatophyte species and strains with PCR amplification［J］. Exp Ther Med，2014，8（2）：545-550.

［3］ Ballin N Z，Vogensen F K，Karlsson A H.Species determination can we detect and quantify meat adulteration？［J］.Meat Sci，2009，83（2）：165-174.

［4］ Ballin N Z.Authentication of meat and meat products［J］.Meat Sci，2010，86（3）：577-587.

［5］ Liu X，Han L，Veys P，et al.An overview of the legislation and light microscopy for detection of processed animal proteins in feeds［J］.Microsc Res Tech，2011，74（8）：735-743.

［6］ Boselli E，Pacetti D，Curzi F，et al.Determination of phospholipid molecular species in pork meat by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and evaporative light scattering detection［J］.Meat Sci，2008，78（3）：305-313.

［7］ Chen Y，Hsieh Y P.A sandwich ELISA for the detection of fish and fish products［J］.Food Control，2014，40：265-273.

［8］ Regecova I，Pipova M，Jevinova P，et al.Species identification and antimicrobial resistance of coagulase-negative staphylococci

isolated from the meat of sea fish［J］.J Food Sci，2014，79（5）：898-902.

［9］ Saez R，Sanz Y，Toldra F.PCR-based fingerprinting techniques for rapid detection of animal species in meat products［J］.Meat Sci，2004，66（3）：659-665.

［10］ Kesmen Z，Sahin F，Yetim H.PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages［J］.Meat Sci，2007，77 （4）：649-653.

［11］ Wang Q，Zhang X，Zhang H Y，et al.Identification of 12animal species meat by T-RFLP on the 12SrRNA gene［J］.Meat Sci，2010，85（2）：265-269.

［12］ Murugaiah C，Noor Z M，Mastakim M，et al.Meat species identification and Halal authentication analysis using mitochondrial DNA［J］.Meat Sci，2009，83（1）：57-61.

［13］ Mahajan M V，Gadekar Y P，Dighe V D，et al.Molecular detection of meat animal species targeting MT 12SrRNA gene ［J］.Meat Sci，2011，88（1）：23-27.

［14］ Kesmen Z，Gulluce A，Sahin F，et al.Identification of meat species by TaqMan-based real-time PCR assay［J］.Meat Sci，2009，82（4）：444-449.

［15］ Soares S，Amaral J S，Mafra I，et al.Quantitative detection of poultry meat adulteration with pork by a duplex PCR assay ［J］.Meat Sci，2010，85（3）：531-536.

［16］ Ppel R K，Ruf J，Rentsch J.Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef，pork，horse and sheep［J］.Europ Food Res Technol，2011，232（1）：151-155.

［17］ Ppel R K，Ruf J，Zimmerli F，et al.Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef，pork，chicken and turkey［J］.Europ Food Res Technol，2008，227 （4）：1199-1203.

［18］ Kitpipit T，Sittichan K，Thanakiatkrai P.Direct-multiplex PCR assay for meat species identification in food products［J］. Food Chem，2014（163）：77-82.

［19］ Dalmasso A，Fontanella E，Piatti P，et al.A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs［J］. Mol Cell Probes，2004，18（2）：81-87.

［20］ Lin C C，Fung L L，Chan P K，et al.A rapid low-cost highdensity DNA-based multi-detection test for routine inspection of meat species［J］.Meat Sci，2014，96（2）：922-929.

［21］ Ulca P，Balta H，Cagin I，et al.Meat species identification and Halal authentication using PCR analysis of raw and cooked traditional Turkish foods［J］.Meat Sci，2013，94（3）：280-284.

［22］ Sakalar E，Abasiyanik M F，Bektik E，et al.Effect of heat processing on DNA quantification of meat species［J］.J Food Sci，2012，77（9）：40-44.

［23］ Smolina I，Kollias S，Poortvliet M，et al.Genome and transcriptome-assisted development of nuclear insertion/deletion markers for Calanus species（Copepoda：Calanoida）identification［J］.Mol Ecol Resour，2014，14（5）：1072-1079.

［24］ 邵碧英，张体银，杨 婕，等.动物产品及饲料中牛源和羊源性成分PCR检测方法的优化［J］.中国兽医科技，2005，35（3）：225-229.

［25］ 赵 冉，蔡振鸿，陈永锋.动物产品及饲料中牛源和羊源性成分三重荧光PCR检测方法的建立［J］.畜牧与兽医，2012，44 （7）：18-22.

［26］ 陈永锋.饲料及动物性食品中山羊源性和绵羊源性成分双重荧光PCR检测方法的建立［J］.福建畜牧兽医，2012，34（3）：1-4.

［27］ 周详山，张元兴，吕 品，等.中药中龟源形成分的PCR鉴定方法［P］.中国专利：CN101838684A，2010-09-22.

［28］ 周详山，张元兴，吕 品，等.中药中马种源形成分的PCR鉴定方法［P］.中国专利：CN101812509A，2010-08-25.

专论与讲座

［29］ 刘金华，史艳宇，刘 韬，等.实时荧光PCR检测貉子源性成分的引物探针及方法［P］.中国专利：CN103451304A，2013-12-18.

［30］ 郭云霞，包建强，张舒亚，等.食品中鲨鱼源性成分真实性PCR鉴别研究［J］.食品工业科技，2011，32（10）：421-424.

［31］ 孙 敏，高宏伟，龚 方，等.利用线粒体COI序列快速检测狐源性成分［J］.畜牧与兽医，2013，45（7）：57-60.

Progress on Detection Techniques of Derived Materials

LI Li-juan1，YUAN Xiao-long2
（1.Institute of Bijie Test Area，Guizhou University of Engineering Science，Bijie，Guizhou，551700，China；2.College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong，510642，China）

Abstract：Since the BSE and avian influenza erupted，most of the countries has regarded the safety of foods and feed as a major issue that relates to national public safety.With the increasing of living standard，people pay more attention to the quality of life，however，there are often fakes and shoddy phenomenon in practices.Consequently it urgently needs the source detection of components，and the source detection becomes the criterion.As far as it goes，the source detections of components have been related to all sectors of all our life.The origin of the source detection of components，its application and the methods were reviewed. Through the summary we expected to provide certain theoretical basis for detecting authenticity of merchandises，making an appraisal of quality and preventing the spread of animal diseases.

Key words：animal-derived material；species identification；detection technology

作者简介：李丽娟（1983-），女，甘肃白银人，硕士，助理研究员，主要从事分子遗传育种研究。

基金项目：贵州省科学技术 （黔科合J字LKB［2013］18号）

收稿日期：2014-08-28

中图分类号：S852.743

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）05-0107-04