鸡源大肠杆菌耐药性分析及中药对大肠杆菌耐药性消除作用的研究

宁官保，牛艺儒，张 鼎，李宏全，马海利，高荣琨，郝卫芳，高文伟，赵宇军，高诗敏，李桂兰，李建慧，闫 芳，田文霞*

(1.山西农业大学动物科技学院，太谷 030801；2.山西省长治市畜牧兽医局，长治 046000；3.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；4.太原市动物疫病预防控制中心，太原 030024)

鸡源大肠杆菌耐药性分析及中药对大肠杆菌耐药性消除作用的研究

宁官保1，牛艺儒2，张 鼎3，李宏全1，马海利1，高荣琨1，郝卫芳4，高文伟1，赵宇军1，高诗敏1，李桂兰1，李建慧1，闫 芳1，田文霞1*

(1.山西农业大学动物科技学院，太谷 030801；2.山西省长治市畜牧兽医局，长治 046000；3.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；4.太原市动物疫病预防控制中心，太原 030024)

研究鸡源大肠杆菌耐药性及中药对大肠杆菌耐药性消除作用。选择22种抗生素采用Kirby-Bauer法对山西省部分地区分离的20株致病性鸡源大肠杆菌进行耐药性检测，对分离菌株进行质粒分析和耐药质粒转化试验，并分析多种中药对大肠杆菌耐药性的消除作用。结果显示，20株试验菌对测试抗生素均存在不同程度的耐药性，其中5耐及5耐以上的菌株占分离菌株的90%，试验菌对青霉素耐药率最高(90%)，其次为恩诺沙星(85%)，而对黏杆菌素和呋喃妥因的耐药性最低；分离出12种质粒谱型，同一地区、同一鸡场菌株的质粒图谱相同或相似，不同地区菌株的质粒图谱不同，仅有部分相同或相近的流行质粒共存；对其中5株菌株进行耐药质粒的转化试验，发现同一质粒可编码1个至数个耐药性基因，不同质粒可以携带相同的耐药性基因；中药单剂或合剂对大肠杆菌的耐药性有一定的消除作用，其中黄芩的消除效果最好，中药处理后部分菌株质粒图谱无变化，只有黄连和双黄连造成2条质粒带丢失；对中药提取物作用后的消除子进行药敏试验，结果发现大肠杆菌对环丙沙星等多种抗生素恢复了敏感性。研究结果提示联合使用中药治疗鸡源大肠杆菌病有显著效果。

鸡；大肠杆菌；耐药；质粒；中药

鸡致病性大肠埃希菌(Escherichiacoli)是引起鸡大肠杆菌病的病原体，主要导致病鸡大肠杆菌性败血症、肉芽肿、心包炎、肝周炎、气囊炎、肠炎、脐炎、全眼球炎和卵黄性腹膜炎等症状，并对雏鸡和胚胎鸡具有很高的致死性[1]。鸡致病性大肠杆菌感染还可以作为鸡禽流感、新城疫、传染性支气管炎等病毒性疾病的继发病出现，进一步加剧疾病发展，对鸡生命健康和养鸡产业构成巨大威胁[2]。伴随着抗生素在家禽养殖上的过度使用或滥用，鸡大肠杆菌对药物的耐药性不断增加，病鸡死亡率不断提高。鸡大肠杆菌耐药性的产生涉及多种机制，其中大肠杆菌耐药性的增加与自身耐药质粒的产生有着密切的关系。而且细菌携带的耐药质粒，尤其是R质粒，具有遗传性，可以在不同菌株、菌种间进行传递，使得耐药性细菌持续增加、流行。研究发现，某些中草药能够消除细菌的耐药质粒，起到抑制细菌耐药性的作用[3]，这为鸡大肠杆菌耐药性的消除提供新的思路。

作者从山西省不同地区患大肠杆菌病的病鸡中分离出20株致病性大肠杆菌，并挑选22种抗生素，对这些大肠杆菌的耐药性进行检测。同时，试验提取大肠杆菌质粒，比较各菌株质粒谱型，揭示耐药质粒与大肠杆菌耐药性的关系。在细菌耐药性检测结果基础上，试验还研究中药单剂或合剂对大肠杆菌耐药性的消除作用，为大肠杆菌耐药性的消除探索新的方法。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

20株鸡致病性大肠杆菌从山西省不同地区鸡场送检的病鸡中分离。其中1～7号分离自临汾市；8～10号分离自太原市；11～14号分离自太谷县；15～16号分离自文水县；17～20号分离自平遥县。大肠杆菌质控菌株ATCC25922购自北京天坛药物技术开发公司。质粒转化使用的受体菌株DH5α购自Promega公司。

1.2 药敏纸片

利福平(RA)、庆大霉素(GM)、黏杆菌素(PMB)、卡那霉素(K)、环丙沙星(CIP)、阿莫西林(AMX)、头孢噻肟(CTX)、氧氟沙星(OFL)、红霉素(E)、诺氟沙星(NOR)、强力霉素(DO)、泰乐菌素(TL)、氟苯尼考(FF)、恩诺沙星(ENR)、氨苄西林(AM)、头孢曲松钠(CFX)、头孢拉啶(CED)、呋喃妥因(NFT)、四环素(TE)、青霉素(P)、链霉素(S)、阿米卡星(AMK)等购自杭州天和药物技术开发公司。

1.3 中药

大黄、黄连、黄芩、金银花、连翘、三黄汤和双黄连口服液均购自太谷广誉远中药房。

1.4 抗菌药物

庆大霉素标准品购自中国药品生物制品检定所。

1.5 菌株分离

鸡大肠杆菌的分离、纯化和鉴定参照文献方法进行[4-5]。

1.6 药敏试验

药敏试验参照临床和实验室标准协会(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)推荐的Kirby-Bauer法进行[6]。每次测定均以标准质控菌株ATCC25922作参照。结果判定按CLSI 2008年标准进行，级别分为耐药(R)、中度敏感(M)和敏感(S)三种。每株菌株的药敏试验均做3次重复，耐药率取三次重复试验结果的平均值。

1.7 大肠杆菌质粒提取及谱型鉴定

SDS碱裂解法提取细菌质粒，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA，凝胶成像系统记录试验结果，并按照文献[7]的方法测定质粒相对分子质量。

1.8 大肠杆菌耐药质粒的转化试验

试验选取耐庆大霉素的5个菌株为研究对象，提取菌株质粒，导入用大肠杆菌DH5α制备的感受态细菌，37 ℃环境LB培养基中培养18 h筛选转化子。以大肠埃希菌ATCC25922为质控菌，进行原菌株与转化子的耐药性试验，判断耐药性质粒的转化效果。

1.9 中药对耐药菌耐药性消除试验

1.9.1 中药亚抑菌质量浓度的选择 药敏试验结果显示，9号菌株耐药谱最广，达到19耐，所以中药对大肠杆菌耐药性消除试验部分作者选择以9号菌株为试验对象。所得试验结果用与9号菌株具有相同耐药谱的另外两株菌株进行验证。调整9号株大肠杆菌浓度至1×104CFU·mL-1，各取100 μL加入到中草药提取液起始质量浓度为200 mg·mL-1的2倍梯度稀释的LB培养基中，一共9管，另设1管不加药物的培养基作为对照。观察细菌生长状况，并判定各中药提取物对受试菌的亚抑菌质量浓度。化学消除剂SDS的亚抑菌质量浓度为100 μg·mL-1。1.9.2 中药单剂或合剂对鸡源大肠杆菌耐药性消除试验 取9号菌株液100 μL，接种于含亚抑菌质量浓度中药的 LB肉汤中，分别培养 24、48和72 h。设SDS处理组为对照组。取100 μL菌液接种于GC板，待长出单个菌落后，随机挑选500个菌落，以影印培养法，对应点种于含庆大霉素药物质量浓度为100 μg·mL-1的平板和不含药物的普通平板上，18 h后比较各组菌落生长状况。在普通平板上生长而在抗生素平板上不生长的菌落即为消除子。根据消除菌落数与菌落总数，计算中药处理后大肠杆菌耐药性的消除率。消除试验在每个时间点均做3次重复，最终消除率取3次重复试验结果的平均值。1.9.3 消除子质粒鉴定和药敏试验 SDS碱裂解法提取消除子质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定谱型与相对分子质量大小，并对中草药作用过的消除子进行药敏试验。

2 结 果

2.1 药敏试验结果及多重耐药性分析

20株大肠杆菌除了对黏杆菌素和呋喃妥因完全敏感外，对其他20种抗生素均有不同程度的耐药性，其中最少的为3耐，最多的为19耐，5耐及5耐以上的菌株占分离菌株的90%，试验菌未出现中介菌株(表1)。大肠杆菌耐药抗生素按严重程度依次为青霉素、恩诺沙星、红霉素、利福平、诺氟沙星、阿莫西林、泰乐菌素、四环素、强力霉素、环丙沙星、氨苄西林、氧氟沙星、链霉素、头孢拉啶、头孢曲松钠、氟苯尼考、庆大霉素、卡那霉素、头孢噻肟、阿米卡星。其中青霉素、恩诺沙星、红霉素、利福平、诺氟沙星、阿莫西林、泰乐菌素、四环素、强力霉素、环丙沙星、氨苄西林、氧氟沙星、链霉素的耐药率都大于或等于50%(图1)。

2.2 大肠杆菌耐药菌株质粒图谱分析

对分离得到的20株鸡源大肠杆菌进行质粒检测。结果显示，分离菌株的质粒获得率为100%，质粒的电泳条带最少为1条，最多为6条，质粒为2.1×102～13.96×103bp(图2)。不同菌株存在相同质粒DNA电泳条带或相同大小质粒。对所得质粒进行图谱分析，共得到12种质粒谱型(表2)。同一地区、同一鸡场菌株的质粒图谱相同或相似，不同地区菌株的质粒图谱不同，但它们之间会有相同或相近的少量流行质粒存在。

2.3 大肠杆菌质粒转化试验结果

试验对5株耐庆大霉素菌株(第7、8、9、10、16号)质粒进行转化后在含有庆大霉素的培养基上培养，其中2株(7、9号)有少量菌落生长。将这2株转化子提取质粒与原供体菌质粒进行谱型比对，均具有相同带型，将转化子获得质粒再进行DH5α重复转化，均获得一致质粒谱型(图3)。转化子与原菌株对22种抗生素敏感性测定结果显示同一质粒可编码1个至数个耐药性基因，而不同质粒可以携带相同或不同的耐药性基因。

表1 20株鸡源大肠杆菌耐药谱

Table 1 Antimicrobial susceptibility of 20E.colistrains isolated from chicken

耐药谱数Numbers耐药谱Antimicrobialresistancespectrum耐药菌株数Strainnumbers3RA/DO/E14ENR/TE/P/S15RA/DO/K/TL/GM16RA/ENR/NOR/AMX/E/P410RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/E/TE/P110TL/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/TE/P/S111DO/TL/CIP/ENR/NOR/AMX/AM/E/TE/P/S111RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/E/TE/P/S112RA/DO/TL/FF/CIP/AMX/AM/CED/E/TE/P/S112RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AME/TE/P114RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/CTX/CED/CFX/TE/P115RA/DO/TL/FF/ENR/NOR/AMX/AMCTX/CED/CFX/E/TE/P/S115RA/DO/TL/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/CTX/CED/CFX/E/TE/P115DO/TL/FF/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/CED/E/TE/P/S/GM119RA/DO/TL/FF/CIP/ENR/OFL/NOR/AMX/AM/CED/CFX/E/TE/P/S/AMK/GM/K3

图1 20株鸡源大肠杆菌耐药率分析Fig.1 Resistance rate of E.coli(n=20)strains isolated from chicken

2.4 中药对鸡源大肠杆菌耐药性消除作用

9号菌株用亚抑菌浓度的不同中药处理，结果表明，各中药提取物对大肠杆菌耐药性均具有消除作用，且消除效率随着处理时间的延长(24～72 h)持续上升(图4)，其中三黄汤、双黄连合剂对大肠杆菌耐药性消除率高于其他中药单剂量，而单剂中黄芩的消除效果最好。试验同时对与9号菌株具有相同耐药谱的另外两株菌株(8号和10号)进行验证，均得到一致结论。

2.5 消除子质粒鉴定和药敏试验

由图5可知，9号菌株在5种中药作用后质粒带无变化，经黄连(4)和双黄连(7)提取液作用后各丢失了2条质粒带(6 670和210 bp)。对中草药作用过的消除子进行药敏试验，结果发现，该菌株对多种抗生素恢复了敏感性，其中对CIP、ENR、OFL、NOR、AMX、AM、S、AMK、GM和K等均由耐药转变为敏感。

M.DL15000相对分子质量标准；1～20.大肠杆菌质粒M.DL15000 marker；1-20.plasmid of E.coli strains图2 20株鸡源大肠杆菌质粒电泳图谱Fig.2 Plasmid profile of 20 E.coli strains isolated from chicken

表2 20株鸡源大肠杆菌质粒谱型

Table 2 Plasmid profiles ofE.coli(n=20)strains isolated from chicken

质粒谱型Plasmidtypes质粒含有的碱基数/kbPlasmidbases菌株数Numbers菌株来源SourceP15.901临汾市P27.771文水县P38.871太谷县P47.911.934平遥县P56.152.710.951临汾市P66.152.181.101临汾市P76.342.620.951临汾市P812.936.341.111临汾市P912.938.036.982临汾市P1013.936.150.951文水县P1113.9311.356.152.273太谷县P1212.8310.186.672.711.680.213太原市

3 讨 论

大肠杆菌的耐药性受多种因素影响，不同地区大肠杆菌耐药种类会有所不同，且在不同时期分离的菌株耐药性也有较大差异[8-11]。所以对当地鸡源大肠杆菌耐药性和耐药谱的调查，能在一定程度上反映当地抗生素使用情况，为鸡大肠杆菌病的治疗提供参考依据。本试验调查了山西省鸡源大肠杆菌对各类抗生素的耐药情况，发现大肠杆菌对青霉素类、大环内酯类、四环素类、喹诺酮类抗生素耐药性均在50%以上，其中以青霉素类抗生素耐药率最高；氨基糖苷类抗生素、硝基呋喃类抗生素和头孢菌素类抗生素的耐药率较低，而对硝基呋喃类抗生素全部敏感。这些调查结果可以为当地鸡大肠杆菌病治疗用药选择提供很好的依据。

面对鸡源大肠杆菌抗生素耐药性问题的日益严重，人们将注意力转向利用中药来抑制大肠杆菌的耐药性。研究指出，一些中药提取剂具有良好的抗菌活性，并且与抗生素联合使用时可以增强抗生素的抗菌活性，起到联合治疗的效果[12]。中药对大肠杆菌耐药性的抑制与其对菌体内耐药性质粒的清除有密切的关系。陈群等发现黄连对大肠杆菌R质粒具有明显的消除作用，黄连作用24 h，大肠杆菌R质粒消除率为2.42%，48 h时，其消除率可提高为22.57%[13]。张寅晨等用连翘对导入含有Ampr基因质粒的大肠杆菌作用12 h，质粒DNA电泳检测后发现连翘对大肠杆菌质粒具有显著消除作用[14]。最近张文平等的研究发现，金银花水浸液对大肠杆菌R质粒也有显著的消除作用[15]。而目前还没有关于黄芪、大黄对大肠杆菌耐药性和质粒消除作用研究的报道。本试验中，作者发现黄芩、大黄、金银花、黄连、连翘等五种中药单剂和三黄汤、双黄连两种方剂对鸡源大肠杆菌耐药性均表现出不同程度的消除效果，且中药方剂对大肠杆菌耐药性的消除率高于单味中药。这一结论与其他研究结果相吻合[16]。质粒图谱分析结果表明，只有黄连和双黄连能引起大肠杆菌质粒谱型的改变，其他中药作用后质粒带均无变化。这提示各味中药对大肠杆菌的抑制机制并不相同。黄连和双黄连造成大肠杆菌6 670和210 bp两条质粒带消失，推测鸡大肠杆菌携带6 670和210 bp的质粒介导了对环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星等耐药性的产生。黄连和双黄连可以通过消除耐药质粒基因的办法提高对大肠杆菌耐药性的清除率。黄芪、大黄、金银花等中药则可能通过其他途径实现对大肠杆菌耐药性的清除，这些途径可能涉及整合子、转座子、染色体等遗传物质的改变[17]。

M.DL15000相对分子质量标准；1.DH5α；2.第9号菌株；3.第9号菌的转化子；4.第7号菌；5.第7号菌的转化子M.DL15000 marker；1.DH5α；2.No.9 plasmid of E.coli strains；3.No.9 plasmid after transformation；4.No.7 plasmid of E.coli strains；5.No.7 plasmid after transformation图3 耐药质粒转化后电泳图谱Fig.3 Profile of isolated plasmid after transformation

图4 不同中药对大肠杆菌耐药性消除率Fig.4 The clearance rate of colony (%) different Chinese herb against resistant E.coli strains from chicken

M.DL15000相对分子质量标准；1.黄芩处理；2.大黄处理；3.金银花处理；4.黄连处理；5.连翘处理；6.三黄汤处理；7.双黄连处理M.DL15000 marker；1.Scutellaria baicalensis treatment；2.Rheum officinale treatment；3.Honeysuckle treatment；4.Coptis chinensis treatment；5. Fructus forsythiae treatment；6.Sanhuangtang treatment；7.Shuanghuanglian treatment图5 中草药提取物处理后大肠杆菌质粒电泳图谱Fig.5 Profile of isolated plasmid after drug treatment

4 结 论

用中药对鸡大肠杆菌作用后进行药敏试验，大肠杆菌对多种抗生素恢复了敏感性。因此，联合使用中药可以提高抗生素对鸡源大肠杆菌的杀灭效果，具有很好的推广价值。

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(编辑 白永平)

Studies on the Drug Resistance of Chicken IsolatedEscherichiacoliand Role of Traditional Chinese Medicines in the Drug Resistance Elimination

NING Guan-bao1，NIU Yi-ru2，ZHANG Ding3，LI Hong-quan1，MA Hai-li1，GAO Rong-kun1，HAO Wei-fang4，GAO Wen-wei1，ZHAO Yu-jun1，GAO Shi-min1，LI Gui-lan1，LI Jian-hui1，YAN Fang1，TIAN Wen-xia1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.ChangzhiAnimalHusbandryandVeterinaryBureau，Changzhi046000，China； 3.CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China； 4.TaiyuanCenterforDiseaseControlandPrevention，Taiyuan030024，China)

The aim of this study was to study the drug resistance of chicken isolatedEscherichiacoliand role of traditional chinese medicines in the drug resistance elimination.Twenty kinds ofE.coliisolated from chicken around Shanxi province were tested to determine the resistant rate to 22 kinds of antibiotic by Kirby-Bauer way，the plasmid analysis and transformation test were conducted.Based on the resistance test results to antibiotic，we also evaluated the elimination effects of several traditional Chinese medicine (TCM) extracts on the isolated chickenE.coli.The results showed that the percent ofE.coliresistant to above 5 kinds of antibiotics reached 90%.The isolatedE.coliexhibited the strongest resistant rate to Penicillin G (90%)，followed by Enrofloxacin (85%)，while exhibited the highest sensitivity to Colimycin and Furadantin.According to the plasmid analysis results，12 kinds of plasmid patterns in total were found.Plasmids collected from the near farms with each other were likely to have the similar patterns，while different types among diverse areas.The transformation test results showed that one plasmid could encode single or several resistance genes，and different plasmids could have same resistance gene as well.TCM extracts，especiallyScutellariabaicalensis，had significant elimination function to the drug resistantE.coli.Majority of the TCM treated plasmids maintain the same patterns，while two plasmids change their profiles after treating with coptis chinensis and shuanghuanglian，losing two DNA bind respectively.After all，TCM extract treatment recovered the susceptibility of chickenE.colito drugs，which support the permitted use of TCM on the chickenE.colidisease control.

chicken；Escherichiacoli；drug resistance；plasmid；traditional Chinese medicine

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.019

2014-12-08

山西省自然科学基金(2014011028-1；2009011043-1)；山西省科技攻关项目(20130311027-3)；国家自然科学基金(31072179)

宁官保(1961-)，男，山西闻喜人，副教授，主要从事生物技术在动物传染病学与免疫中的应用研究，E-mail：ningguanbao034@163.com

*通信作者：田文霞，E-mail：wenxiatian@126.com

S855.1;S852.612

A

0366-6964(2015)06-1018-08