双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库的构建与鉴定

胡湘云，高小龙，付向晶，刘丹丹，范文涛，王燕平，杜恩岐，王兴龙，党如意，杨增岐

(西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100)

双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库的构建与鉴定

胡湘云，高小龙，付向晶，刘丹丹，范文涛，王燕平，杜恩岐，王兴龙，党如意，杨增岐*

(西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100)

构建双峰驼天然重链抗体可变区(VHH)酵母双杂交文库，并对文库质量进行鉴定。采集未经免疫的6月龄雌性双峰驼外周血、骨髓、脾和淋巴结，并从外周血中分离淋巴细胞。抽提总RNA，反转录为cDNA，用2对引物经过2轮PCR扩增得到400 bp左右的双峰驼VHH片段。根据Clontech公司Mate & PlateTMlibrary construction system使用手册，将带有同源臂的VHH片段与线性化的pGADT7-Rec质粒共转化Y187酵母感受态细胞，转化产物涂布SD/-Leu平板，30 ℃倒置培养3～5 d后，收集平板上的所有克隆，即为双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库。对文库的滴度、重组效率及多样性进行鉴定。结果显示，本研究构建的双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库库容为2.07×107，滴度为7.6×108cfu·mL-1。随机挑取47个独立克隆进行菌落PCR鉴定，43个含有VHH片段，重组率为91.5%；选取其中19个测序，均为独立克隆，且多样性好。该研究成功构建双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库，且文库质量满足要求，为进一步获得特定抗原的VHH奠定了基础。

双峰驼；重链抗体可变区；酵母双杂交

重链抗体可变区(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)是目前研究热度最高的基因工程抗体之一[1-2]，其衍生于骆驼科动物和鲨鱼体内天然存在的重链抗体，是目前发现天然存在的具有抗原结合功能的最小抗体片段，相对分子质量仅为15 ku，为传统抗体的1/10[3-4]。由于VHH呈椭球形，高度仅为4.8 nm，直径仅为2.2 nm，因此又被称为纳米抗体(nanobodies，Nbs)。相对传统的单克隆抗体而言，VHH具有一些独特的优点，如相对分子质量小，容易制造和表达，高水溶性且稳定性强，能识别隐蔽表位和酶的裂隙，可以表达成胞内抗体，具有较高的亲和力及低免疫原性等[5-6]。上述特点使VHH在医学诊断和治疗以及蛋白质组学方面受到越来越高的重视[7-8]。

目前VHH的制备技术包括噬菌体展示技术、酵母展示技术和核糖体展示技术等，其中噬菌体展示技术最为常用[9-10]。噬菌体展示技术所构建的抗体库可分为免疫文库和非免疫文库，非免疫文库由于未经抗原刺激，所以抗体多样性强于免疫库，一旦构建完成，可用多种抗原进行筛选，避免了免疫动物这一繁琐的环节，缩短了抗体制备时间，在新疫病快速诊断治疗中更具优势[8，11]。虽然噬菌体展示抗体库技术应用广泛，但其存在一定的缺陷，例如：噬菌体展示抗体库使用原核表达系统将抗体展示在噬菌体表面，缺乏翻译后修饰能力，可能会引起抗体活性降低，导致假阴性结果出现；同时其筛选过程是在体外进行的，不适合研究抗原抗体在细胞内反应活性。

利用酵母双杂交抗体库则可实现抗原抗体在真核细胞内表达与筛选，弥补了噬菌体展示抗体库原核表达展示导致抗体活性降低这一缺陷，能更好地反映抗原抗体在体内反应的情况，并且避免了噬菌体抗体库筛选前期抗原制备环节。因此，相对噬菌体展示抗体库而言，酵母双杂交抗体库具有其独特优势[12]。X.Fu等学者构建了PCV2 VHH酵母双杂交文库，并成功筛选出了Cap蛋白的VHH[13]。但目前尚未见有关双峰驼天然VHH酵母双杂交文库构建的报道。为此，本研究拟构建双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库，并对文库质量进行评价，为后续筛选多种抗原的VHH奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

Ficoll Paque PLUS购自Amersham Pharmacia Biotech；总RNA提取试剂盒(RNeasy®Plus Mini Kit)和胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；2K plus DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司；TaqDNA聚合酶、反转录试剂盒和DL2000 DNA marker购自TaKaRa公司；SD/-Leu选择性培养基、YPDA培养基、50% PEG 3350、10×TE、10×LiAc、Yeastmaker Carrier DNA和3 mol·L-1醋酸钠溶液等试剂均购自Clontech公司；DMSO、甘油购自Sigma公司；琼脂糖购自Invitrogen公司；无水乙醇等其他试剂为国产分析纯。

1.2 菌株及载体

Y187酵母菌和pGADT7-Rec线性化载体购自Clontech公司。

1.3 实验动物

6月龄雌性双峰驼，购于甘肃金昌。

1.4 引物设计

根据GenBank上收录的VHH的核苷酸序列，设计了两对引物用于扩增VHH片段。CALL01和CALL02为第一对引物，用以扩增大小分别为900 bp的VH-CH1-CH2片段和600 bp的VHH-CH2。VHH-up和VHH-down为第二对引物，用以从600 bp的VHH-CH2中扩增得到大小约为400 bp的VHH片段。T7和3′AD为pGADT7-Rec载体上的通用引物，用于文库质量的PCR鉴定(表1)。引物由南京金斯瑞公司合成。

表1 文库构建及鉴定所用引物

Table 1 Primers used for library construction and characterization

引物Primer核苷酸序列(5'-3')Primersequence(5'-3')CALL01GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGCALL02GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCCVHH-upTTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGGAGTCTGGRGGAGGVHH-downGTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGGAGACGGTGACCWGGGTT7TAATACGACTCACTATAGGG3'ADAGATGGTGCACGATGCACAG

斜体部分为同源臂

Letters in italics is the homologous arms

1.5 样品采集、淋巴细胞分离、总RNA的提取及反转录

双峰驼安乐死后，无菌采集脾、淋巴结和骨髓，立即置液氮保存备用，之后用液氮进行研磨。颈静脉采血，收集抗凝血与等体积磷酸缓冲液PBS(pH 7.4)混合，加入Ficoll Paque PLUS淋巴细胞分离液进行淋巴细胞分离。参照总RNA提取试剂盒说明书抽提淋巴细胞、脾、淋巴结和骨髓的总RNA，置于-80 ℃保存。以总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，在M-MLV逆转录酶作用下反转录进行第一条链cDNA的合成，置于-20 ℃保存。

1.6VHH片段的扩增

以反转录的cDNA为模板，用引物CALL01和CALL02在TaqDNA聚合酶的作用下，进行第一轮PCR扩增。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，预期会出现大小为900和600 bp两条带。

切胶回收600 bp左右目的条带，以此为模板，用引物VHH-Up和VHH-Down在TaqDNA聚合酶作用下进行第二轮PCR扩增获取VHH片段，反应条件：95 ℃ 5 min；95℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33个循环；72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带，预期条带大小400 bp。用胶回收试剂盒回收400 bp的VHH片段，并测定其浓度。

1.7VHH片段的浓缩

向回收的400 bpVHH片段中加入1/10体积3 mol·L-1醋酸钠和2.5倍体积预冷的无水乙醇，用乙醇沉淀法对其进行浓缩。最后溶于20 μL灭菌水中，并测定浓度，使得浓缩后质量浓度达到2～5 μg·20 μL-1。

1.8 Y187感受态细胞的制备与转化

根据Clontech公司Yeastmaker Yeast Transformation System 2的操作说明，进行Y187酵母感受态细胞的制备。依照Mate & PlateTMLibrary System使用手册的操作说明和参考文献[13]，进行VHH片段和pGADT7-Rec转化Y187酵母感受态细胞。取转化后的产物涂布80～100个150 mm SD/-Leu选择性营养培养基平板，30 ℃培养3～5 d。

1.9 文库菌的收获

待平板上长出菌落后，置于4 ℃固化3～5 h；加入YPDA液体培养基(含25%甘油)，用已灭菌的涂菌棒刮取平板上的所有菌落，充分混匀后，置于-80 ℃保存备用。

1.10 双峰驼VHH抗体库的库容量、滴度和多样性鉴定

按照Mate & PlateTMLibrary System User Manual的操作说明采用梯度稀释法，分别将转化产物和文库菌做倍比稀释，涂布SD/-Leu选择性营养培养基平板，30 ℃倒置培养3～5 d，计数各稀释梯度平板上的菌落数，计算抗体库的库容和滴度。

随机挑选SD/-Leu平板上长出的克隆以3′AD和T7为引物进行菌落PCR验证。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，分析文库的重组率。随机挑取菌落PCR呈阳性的PCR产物进行测序，分析文库的多样性。

2 结 果

2.1 淋巴细胞的分离及RNA提取

用淋巴细胞分离液从100 mL的外周血中最终分离到108个单核细胞。用RNA试剂盒抽提的RNA质量浓度为600 ng·μL-1，A260 nm/A280 nm值为2.01，满足建库需要。

2.2 VHH片段的扩增

使用2 μL总RNA(20 μL体系)作为模板，用M-MLV反转录酶进行cDNA的合成。以制备的cDNA为模板，用CALL01和CALL02为引物进行第一轮PCR反应扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，出现两条特异性条带，大小分别为900和600 bp。

M.2K plus DNA相对分子质量标准；1～5.引物CALL01和CALL02扩增的PCR产物；6.阴性对照M.2K plus DNA marker；1-5.PCR products of primer CALL01 and CALL02；6.Negative control图1 第一轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of first round PCR products

回收第一轮PCR产物中600 bp的片段，以此为模板，用引物VHH-up和VHH-down进行第二轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，出现一条与预期一致的400 bp的目的条带，即为VHH片段。

M.DL2000 DNA相对分子质量标准；1-6.VHH PCR产物；7.阴性对照M.DNA marker DL2000；1-6.PCR products of VHH；7.Negative control图2 第二轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of second round PCR products

2.3VHH片段的浓度

400 bpVHH片段经胶回收和浓缩后，测得VHH片段质量浓度为220 ng·μL-1，满足20 μL中含2～5 μg的建库要求。

2.4 文库的库容量和多样性鉴定

将浓缩的20 μL VHH片段和3 μg pGADT7-Rec共转Y187酵母感受态细胞，转化产物进行梯度稀释后涂100 μL于SD/-Leu平板上，经计算文库库容量达2.07×107，满足酵母双杂交文库构建要求。文库菌进行梯度稀释后涂布SD/-Leu平板，经计算文库滴度为7.6×108cfu·mL-1。

从SD/-Leu平板上随机挑取的47个克隆，用通用引物T7和3′AD进行菌落PCR鉴定，结果如图3。琼脂糖凝胶电泳结果显示随机的47个克隆中有43个均为阳性克隆，抗体库的重组率达91.5%，显示文库的插入率良好。

M.2K plus DNA相对分子质量标准；1～47.随机挑选的菌落；48.阴性对照M.2K plus DNA marker；1-47.Randomly picked colonies；48.Negative control图3 文库菌落PCR鉴定Fig.3 Colony PCR identification results

随机挑选19个菌落PCR呈阳性的PCR产物进行测序，测序结果与NCBI发表的VHH进行Blast比对分析，结果显示这些序列与骆驼属的重链抗体重链可变区高度同源，均为VHH。用Clone Manager软件对19个序列进行相互比对，结果如图4，显示此19个VHH序列均为独立克隆，且在FR1区22位、FR3区102位特定位置均含有半胱氨酸，FR2区37、44、45、47位的氨基酸碱基由疏水性碱基变为亲水性碱基，符合纳米抗体的结构特征，表明抗体库多样性较好。19个序列的GenBank登录号为RF179360～179383。

“.”表明与第一行序列相同的序列，不同的序列由阴影区表示，“-”表明缺失的序列，FR1、FR3区实线图框内为半胱氨酸残基，FR2区虚线图框内为纳米抗体4个保守的特有的亲水性碱基The dots denote the same sequences compared with VHH1，differences in the sequence are shadowed，and the dash shows the missing sequences.The hallmark Cys residues in FR1 and FR3 are denoted by the thick-line boxes.The four conservative hallmark residues of VHH in FR2 are denoted by the dotted line boxes.图4 19个VHH片段的氨基酸序列分析Fig.4 Amino acids sequence alignment of 19 VHH antibody fragments

3 讨 论

针对目前在疾病治疗和蛋白质功能研究上面临的缺少能在细胞内发挥功能的抗体的这一难题，作者以VHH作为突破口。相对于常规的单链抗体(single chain of variable fragment，scFv)而言，VHH作为一种基于重链抗体的新型抗体，可在真核细胞内更好地正确折叠，且可溶性强、表达量大[14]。当前VHH的主流筛选技术为噬菌体展示技术，如前文所述，其存在难以规避的缺陷，而酵母双杂交技术则弥补了这一缺陷。鉴于此点，作者选用酵母双杂交技术构建VHH文库以进行抗体筛选。

文库构建中为了避免VH基因的干扰，作者采取2轮PCR获得VHH[15]。第一轮PCR以CALL01和CALL02为引物成功扩增出约900 bp的VH-CH1-CH2和600 bp的VHH-CH2。第二轮PCR以回收的600 bpVHH-CH2为模板，用引物VHH-up和VHH-down成功扩增VHHFR1到FR4之间的区段，并通过引物上所带同源臂克隆至pGADT7-Rec载体上，随机挑取的19个克隆测序结果显示均符合VHH特征。

文库库容和多样性是文库质量评价的重要指标。本研究采用Clontech公司酵母双杂交技术，通过线性化载体与目的基因末端同源序列，利用同源重组将VHHs序列克隆到载体中，避免了传统酶切和连接这一步骤，简化了操作流程；用PEG/LiAC法进行转化，转化效率可达4.14×106cfu·3 μg-1。从转化后的平板随机挑选克隆进行菌落PCR鉴定，结果显示纳米抗体酵母文库的插入重组率可达91.5%。高的转化效率和重组率保证了最终的文库库容为2.07×107。随机挑取19个克隆进行测序分析，结果显示均为独立克隆，在FR1区第22位和FR3区第102位碱基均含半胱氨酸残基，并且在FR2区上4个位点的氨基酸残基满足Val37Phe/Tyr、Gly44Glu、Leu 45Arg/Cys/His、Trp47Gly/Leu/Glu的特征，与之前关于VHH特征序列的报道相符[16]；表明文库多样性良好。同时FR1区和FR3区的半胱氨酸可稳定长的CDR3区形成的大凸环结构，以便能很好的识别空间构象上的裂隙和空腔结构，37、44、45、47位存在特征性的氨基酸残基替换使得VHH溶解性增强[16]。

综上所述，本研究成功构建了双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库，并对文库滴度、重组率及序列多样性进行鉴定，为进一步筛选特定抗原的VHH奠定基础。

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(编辑 白永平)

Construction and Characterization of a NaiveCamelusBactrianusVariable Domain of Heavy Chain of Heavy-Chain Antibody(VHH)Yeast Two-Hybrid Library

HU Xiang-yun ，GAO Xiao-long，FU Xiang-jing，LIU Dan-dan，FAN Wen-tao，WANG Yan-ping，DU En-qi，WANG Xing-long，DANG Ru-yi，YANG Zeng-qi*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

The aim of this study was to construct and characterize of a naiveCamelusbactrianusvariable domain of heavy chain of heavy-chain antibody(VHH)yeast two-hybrid library.The blood，bone marrow，spleen and lymph node were collected from a healthy non-immunized 6 month-old femaleCamelusBactrianus. And peripheral lymphocytes were isolated from blood samples using Ficoll Paque PLUS reagent.Then total RNA was extracted from peripheral lymphocytes，bone marrow，spleen and Lymph nodes.Reverse-transcription was performed to generate the first-stand cDNA.VHH fragments were amplified through two rounds PCR using two pairs of specific primers.NaiveCamelusBactrianusVHH yeast two-hybrid library was successfully constructed according to Clontech Mate & Plate library construction system user manual.Briefly，5 μg VHHs fragment containing homologous arms in 20 μL were co-transformed with 6 μL linearized pGADT7-Rec plasmid into component Y187 yeast cells，and transformation products were plated on SD/-Leu plates.After 3-5 days incubation at 30 °C，the library was harvested and the library quality were evaluated by titer，recombination efficiency，diversity and complexity.The results showed that there were 2.07×107independent clones in the naive VHH yeast two-hybrid library and the library titer was 7.6×108cfu·mL-1.PCR results showed that 43 independent clones inserted VHHs fragment in 47 randomly picked out clones，and the recombination efficiency was 91.5%.Nineteen independent clones were random picked out to sequence and sequence results indicate they all share unique sequences.In a conclusion，a naiveCamelusBactrianusvariable domain of heavy chain of heavy-chain antibody yeast two-hybrid library was successfully constructed with large capacity，good diversity and complexity，which laid the foundation for preparation VHHs against interested antigens.

Camelusbactrianus；variable domain of heavy chain of heavy chain antibody (VHH)；yeast two-hybrid system

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.025

2014-09-26

国家自然科学基金(31272578)；西北农林科技大学引进人才科研启动基金(Z111021006)

胡湘云(1990-)，女，广西南宁人，硕士，主要从事动物传染病和基因工程抗体的研究，E-mail：821995274@163.com

*通信作者：杨增岐，教授，E-mail：yzq8162@163.com

Q789

A

0366-6964(2015)06-1071-06