公鸡弱精症相关候选基因的表达分析

富　丽，孙研研，薛夫光，刘冉冉，白　皓，常国斌，陈国宏，陈继兰*

(1.扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部畜禽资源与种质创新重点实验室，北京 100193)

公鸡弱精症相关候选基因的表达分析

富丽1，2，孙研研2，薛夫光2，刘冉冉2，白皓2，常国斌1，陈国宏1，陈继兰2*

(1.扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部畜禽资源与种质创新重点实验室，北京 100193)

为了探究公鸡弱精症的发病机理，本研究对前期应用数字基因表达谱技术(Digital gene expression，DGE)及生物信息学分析得到的与公鸡弱精症相关的6个候选基因(COX7B、PTGDS、hPGDS、SPAG6、WNT2、CCNF)进行表达分析。选取300只42周龄的北京油鸡公鸡，进行为期4周的精液品质检测，从中筛出弱精及正常个体各15只。采用RT-qPCR对这6个候选基因在两组个体的睾丸组织的表达量进行相对定量检测。结果发现，COX7B、PTGDS在弱精组个体睾丸的表达量显著高于正常个体(P<0.01)，WNT2、hPGDS、CCNF在弱精组个体的表达量显著低于正常个体(P<0.05)，SPAG6在两组睾丸中的表达量没有显著差异，该结果与DGE的结果相吻合。通过DGE筛选出与弱精症相关的6个候选基因的表达模式在本研究的群体中得到进一步验证，可作为公鸡弱精症的重要候选基因，进一步进行功能分析与验证，为揭示公鸡弱精症的发病机理提供依据。

弱精症；候选基因；睾丸；数字基因表达谱；实时荧光定量PCR

弱精子症(Asthenospermia)是指精液中直线运动的精子(a和b级)小于50%或a级运动的精子小于25%的病症，是影响精液品质的重要病症[1]。目前，弱精症的研究主要集中于人类。在家禽生产中，据不完全统计，每年有5%～12%的种公鸡因产精能力低下而遭淘汰[2]。根据实际生产经验，一些中国地方鸡，存在繁殖效率低下的显著弱点，公鸡精液量低于专门化高产品种25%～50%。因此，探究公鸡弱精症的发病机理，采取科学手段剔除地方鸡中的弱精症个体，提高整体精液水平，对于降低生产成本，加快推进地方鸡的良种化进程，提高养殖效益具有重要意义。

人类相关研究表明，30%的男性不育是由基因突变和染色体异常等遗传缺陷引起[3]。目前国内外学者对于家禽弱精症产生原因的研究主要集中在营养、环境、疾病等外在因素上[4-5]，对于遗传方面的研究甚少。本研究室前期采用DGE，比较无精与正常公鸡睾丸转录组差异，筛选出差异表达基因[6]。胡娟[7]发现，北京油鸡SPAG6基因多态性及其单倍型与精子品质存在相关。在本课题的研究结果基础上，选取弱精和正常公鸡组，通过实时荧光定量PCR的方法，对筛选到的6个重要的弱精症相关候选基因：细胞色素C氧化酶7B (Cytochrome coxidase 7B，COX7B)、前列腺素D2合成酶21 kDa(Prostaglandin D2 synthase 21 kDa，PTGDS)、造血前列腺素D合成酶(Hematopoietic prostaglandin D synthase，hPGDS)、相关精子抗原6 (Sperm associated antigen 6，SPAG6)、无翅型MMTV整合位点家族成员2 (Wingless-type MMTV integration site family member 2，WNT2)、细胞周期蛋白F (Cyclin F，CCNF)在睾丸组织的表达进行分析和验证，以进一步揭示弱精症的发生机理。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1试验动物及试验设计试验动物来自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平试验基地。供试公鸡300只在相同的饲养与管理条件下，从42周龄开始，进行大群筛选试验。根据3周初步观察筛选结果，选留精液量少、精液颜色浅而透明的公鸡，以及相同数量的精液量多、精液颜色浅黄且不透明的正常公鸡。随后每3 d进行定时定员的精液采集，精液品质检测，最终选择出15只弱精和15只正常公鸡。第47周开始，随机挑选300只相同条件下生长的母鸡，按照公母配比为1︰10进行人工授精，每只公鸡收集80～120个种蛋后进行孵化，统计每只公鸡的受精率。57周龄时，屠宰该30只公鸡，迅速采集左侧睾丸样本，取中心部位样本(长1.0 cm×宽1.0 cm×高0.5 cm)放入甲醛固定液(10%福尔马林溶液)保存，用于组织切片制备与观察。其余样本液氮速冻后，于-80 ℃保存用于后续RT-qPCR试验。

1.1.2主要试剂福尔马林溶液购自北京拓英坊科技有限公司；RNA提取Trizol试剂盒购自北京TianGen Biotech公司；PrimeScript RT reagent Kit 和SYBR GREEN 购自大连TaKaRa公司。

1.2试验方法

1.2.1精液品质检测人工按摩法采集精液，用带刻度的采精杯测量收集精液，记录精液量。混匀精液，制成玻片，利用OLYMPUS CX31显微镜，160倍镜下观察精子的运动状态，记录精液中直线运动的精子占总精子数的百分率，即精子活力，并采用10级评分法记录：快速直线运动的精子所占的比例为10%记为1分，20%记为2分；以此类推，得出精子活力统计结果。

1.2.2组织切片观察统计睾丸组织切片由北京博奥泰瑞生物技术公司制作，利用苏木精-伊红(HE)染色。组织切片在显微镜(Olympus CX31)100倍镜下，每个样本取10个视野观察并统计生精小管中形态畸形生精小管所占的比例，在400倍镜下观察生精小管的形态完整性。

1.2.3睾丸总RNA的提取及cDNA的合成取弱精和正常各15个样品，每个样品为30～50 mg冻存睾丸组织，采用Trizol试剂法提取总RNA，并纯化。检测浓度并统一稀释到1 000 ng·μL-1。试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit 反转录合成cDNA，-20 ℃保存。

1.2.4引物设计与合成根据NCBI中鸡的PTGDS、hPGDS、SPAG6、WNT2、COX7B、CCNF基因及内参基因GAPDH的基因序列，采用Primer Premier 5.0软件设计定量引物(表1)，由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2.5qPCR检测相关基因表达以获得的弱精和正常睾丸组织样品的cDNA为模板，利用表1中的引物采用ABI7500型荧光定量PCR仪对COX7B、PTGDS、hPGDS、SPAG6、WNT2、CCNF和内参基因GAPDH在弱精组与正常组中的表达量进行分析。定量PCR反应体系为20 μL：SYBRPremixExTaqII 10 μL，上、下游引物各(10 μmol·L-1) 1 μL，模板cDNA 2 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 5.6 μL。反应条件：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40个循环；熔解曲线收集信号为95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。扩增结束后进行熔解曲线分析，每个样品重复3次，取平均值。

表1引物信息

Table 1Primer pairs information

基因Gene登录号Accessionnumber引物序列(5'-3')Primersequence产物大小/bpProductssize退火温度/℃AnnealingtemperaturePTGDSNM_204259.1F:ACGCTGCTCAGCATCCTGGGGCTGGR:CCTCTTCTCGCACTGTTCAC25159.3hPGDSNM_205011.1F:TTCAATCTGCGAGGAAGAGCR:CCTGATTCTCTGGCGAGGTA20360.6SPAG6NM_001199586.1F:GCGGGAGGCAGGTGTAATR:AGTGCTTCCAGTGCTCCA26159.0WNT2XM_416013.4F:GCTGAAGTCCTGCTCCTGTGR:CGGTTGTTGTGGAGGTTCAT18258.4COX7BXM_001235157.3F:ACAAACTCATCATCGCAAGCR:GGCTGTTACTCCCTCCATTC18058.8CCNFXM_415043.4F:TTCAAGCCTCCCGTCCTATR:ACTTCCACCAGCCAGTCAAC10060.0GAPDHNM_204305.1F:GGAGAAACCAGCCAAGTATGAR:ACCATCAAGTCCACAACACG24059.4

2　结　果

2.1弱精与正常个体的筛选

根据弱精定义和本研究中试验样本筛选结果，将精子活力评分不超过5的归为弱精个体，精子活力评分大于6的为正常个体。根据定义筛选出弱精组和正常组个体各15个。正常与弱精个体精子活力、精液量、受精率的统计数值如表2所示。可以看出，弱精组中个体精液量均少于400 μL，受精率在10%～50%，畸形生精小管的比例大于25%。正常组中个体精液量在600～1 000 μL，受精率不小于60%，畸形小管比例不超过20%。

2.2睾丸组织切片观察与统计

低倍镜下观察并统计畸形生精小管在视野中的比例，高倍镜下观察生精小管的形态完整性。可以观察到弱精组中生精小管形态不完整(图1a)；畸形小管较多；生精小管中各级生精细胞排布散乱(图1b)，中央生成的精子很少。对比正常组生精小管形态完整排布紧密(图1c)，各级生精细胞从外到内有序排列，中央有较多精子生成(图1d)。

2.3候选基因表达结果

使用RT-qPCR检测候选基因的表达，结果如图2所示，COX7B、PTGDS在弱精组表达量高于正常组，且两者之间差异极显著(P<0.01)；hPGDS、WNT2、CCNF在弱精组中表达量低于正常组，且两者之间差异显著(P<0.05)；SPAG6表达量在两组间无显著差异。

3　讨　论

在人类医学上，通过构建基因表达谱来寻找精液品质的遗传基础已成为男性不育研究热点[8-10]。畜禽上，雄性动物的繁殖力很大程度上影响育种进展和经济效益。王竹伟[6]采用DGE，检测到有747个基因在鸡无精症和正常睾丸中表达存在2倍以上的差异。本研究从大群体里筛选多个新样本，通过更为精确的检测手段即RT-qPCR对之前的结果进行进一步验证，揭示弱精症的可能发生的分子机理。结果表明，候选基因COX7B和PTGDS在弱精症公鸡睾丸中的表达量显著上调；WNT2、hPGDS及CCNF基因的表达量则显著下调；SPAG6基因在两组中的表达量差异不显著，该结果与DGE结果吻合，且差异表达的5个候选基因可能参与了弱精症发生。

表2弱精组与正常组精液品质和受精率

Table 2The semen quality and fertility rate of asthenospermia and normal roosters

组别Group精液量/μLSemenvolume精子活力Spermviability受精率/%Fertilityrate畸形生精小管比例/%Percentageofabnormaltesticularseminiferoustubules弱精Asthenospermia216.674.0020.7852.67233.333.6733.3352.00130.004.3318.9253.80163.333.3321.7830.50116.674.3332.2647.00200.002.6734.7841.00200.003.6733.0234.28366.672.3349.2842.00283.332.0012.5045.70366.674.3335.9029.64360.003.0036.1927.85156.674.3327.5336.00166.673.6730.0040.34150.002.6722.5232.00233.332.3319.1441.00平均Average222.89±85.11A3.38±0.82a28.5340.39正常Normal630.006.3370.833.02876.676.6775.7017.65666.677.6772.6316.00600.007.0078.135.00653.337.3374.3610.60716.677.0071.7815.23756.677.5072.6916.23583.337.5062.3913.04456.677.2774.6612.67716.677.7075.785.62750.007.6774.2318.21633.336.7372.5412.47600.007.0376.6611.67590.006.9374.6612.67600.008.0378.135.00平均Average655.33±98.24B7.22±0.46b73.6811.67

同列数据后所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)

Different letters in the same columns means significant difference between the treatments(P<0.05)，same letter in the same columns means not significant difference between treatments(P>0.05)

图1　弱精与正常公鸡细精管切片图(HE染色)Fig.1　Photomicrograph of seminiferous tubules of asthenospermia and normal roosters (H&E staining)

*.P<0.05；**.P<0.01图2　候选基因PTGDS、hPGDS、SPAG6、WNT2、COX7、CCNF在弱精及正常公鸡睾丸组织中的表达Fig.2　The expression of 6 candidate genes in asthenospermia and normal roosters

精子抗原(SPAG)是一类重要的功能蛋白，在调控哺乳动物精子发生、精子运动、精子获能和精卵结合等生物过程中发挥重要的作用。SPAG6蛋白是精子的重要结构蛋白之一，对维持成熟精子完整结构很重要，同时有利于维持精子鞭毛活动[11]。胡娟[7]研究表明，北京油鸡SPAG6 基因多态性及其单倍型与精子品质存在相关。然而本研究室前期DGE研究结果显示，该基因在无精和正常个体睾丸组织中表达量并无显著差异，本研究RT-qPCR也验证了该结果。通常位于基因调控区的SNP会影响基因表达量。SPAG6基因表达量分析与SNP关联分析结论不一致的原因可能主要是前期发现的SNP都位于该基因的内含子区域，并未引起该基因表达量的变化。

精子在精液中的果糖酵解是其首要能量来源，精子分解果糖的能力与精子的密度和活力相关[12]。弱精组中精子活力显著低于正常组(表2)，从而精子分解果糖能力降低，需要启动或增加线粒体中氧化磷酸化和合成ATP的过程来为细胞供能。细胞色素c氧化酶(COX)是线粒体呼吸链电子传递的终末复合物，是线粒体氧化能力的关键酶[13]。其表达会随着氧化磷酸化过程的增加而上调。这可能是在DGE和本研究的弱精个体睾丸组织中COX7B基因表达量明显升高的原因(DGE结果显示该基因为弱精症个体中最上调表达的基因)。在人类上也有研究表明COX7a2在老年人睾丸中的表达显著上调[14]。因此，COX7B基因在弱精症个体的高表达可能不是弱精症产生的原因，而是伴随弱精症发生的一种调控机制。此外，结合睾丸组织切片结果，弱精组生精小管畸形及不完整率较多，睾丸组织可能需要消耗更多的能量来生成成熟精子进而导致COX7B表达量上调。

PTGDS和hPGDS是前期数据库里差异表达基因，是本试验通过Gene Ontology分析获得的显著功能本体条目：前列腺素D合成酶活性(CorrectedP-value = 0.30)中包含的两个重要基因。前列腺素D合成酶(PGDS)包括脑型PGDS(Lipocalin-PGDS，L-PGDS)和生血型PGDS(hPGDS)，两者生化和免疫功能截然不同。L-PGDS即PTGDS，又叫谷胱甘肽非依赖性PGDS，是前列腺素合成酶系的主要成员之一，主要存在于雄性生殖道，在哺乳动物的睾丸中高表达，可能在睾丸的发育、精子的发生及精子成熟等过程发挥重要的作用[15]。研究表明，少精子症患者的精浆中L-PGDS的浓度显著下降[16-17]。E.P.Diamandis等[18]认为这可能是由睾丸组织生精管道的不通畅，精浆减少造成的。DGE及本研究均显示该基因在弱精组的睾丸组织中明显上调，推测可能是弱精个体精浆中L-PGDS的低浓度的负反馈作用促使其在睾丸组织中基因的表达量升高，而生精管道的不通畅可能导致了精浆减少从而L-PGDS含量无法达到正常值。

hPGDS在不同物种间其表达部位也存在差异，小鼠中主要表达于输卵管、皮肤组织中，大鼠中主要表达于输卵管、脾、胸腺等，而在人的心、胎盘及胎儿肝等组织也有表达[15]。本研究中，发现hPGDS在鸡的睾丸组织中也有表达，且在弱精组表达量显著降低。在成年人的睾丸中该基因参与前列腺素生物合成途径[15]，可以推测在鸡hPGDS通过影响前列腺素的合成从而影响睾丸的正常功能和精子的生成。

Wnt信号通路是前期检测到的差异表达基因显著富集的通路。WNT2是该通路上的一个重要基因。WNT2主要与结直肠癌、胃癌、食管鳞状细胞癌及恶性胸膜间皮癌等的发生有关，它参与调控特定基因的表达[19]。DGE结果显示该基因在无精和正常个体中的表达差异达到28[6]，本研究也证明该基因在弱精个体中的表达量显著低于正常组。揭示该基因可能参与调控睾丸组织的生精过程。DWnt2 (Drosophila Wnt2)是果蝇所特有的，是果蝇雄性生殖系统发育所必须的，影响其睾丸的发生[20]。类似地可以推测Wnt2表达量的降低可能导致鸡畸形生精小管的比例上升从而降低产精质量。

细胞周期蛋白与有丝分裂、减数分裂密切相关。细胞周期蛋白(CCNF)具有调节细胞周期使其顺利过度的重要功能，它保证细胞在支持细胞分裂的环境信号的作用下进行正常增殖[21]。各级生精细胞周期间的转换，及各级生精细胞的生成和精子都需要细胞周期蛋白[22]。在无精症公鸡睾丸组织中，CCNF基因表达显著降低(图2)，可能导致各级生精细胞周期的更替无法进行，精子生成发生障碍。

精子发生过程经历了复杂的细胞分化阶段，并受许多因素的影响。本研究应用RT-qPCR对6个弱精症重要候选基因的表达进行了分析和验证，并进一步探讨了弱精症的机制，对弱精症的诊断和发生机理的揭示提供了重要基础。

[1]Word Health Organization (WHO).Laboratory manual of the WHO for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction[J].Ann1stSuperSanita，2001，37(1)：Ⅰ-Ⅻ，1-123.

[2]陈蓉.禽类Piwill基因与piRNAs生物学功能的初步研究[D].扬州：扬州大学，2013. CHEN R.Preliminary study on the biological function of Piwill gene and piRNAs in poultry[D].Yangzhou：Yangzhou University，2013.(in Chinese)

[3]HOPPS C V，MIELNIK A，GOLDSTEIN M，et al.Detection of sperm in men with Y chromosome microdeletions of the AZFa，AZFb，and AZFc regions [J].HumanReprod，2003，18(8)：1660-1665.

[4]NEUMAN SLEUMAN S L，ORBAN J I，LIN T L，et al.The effect of dietary ascorbic acid on semen traits and testis histology of male turkey breeders [J].PoultSci，2002，81(2)：265-268.

[5]VILLARREAL L Y，BRANDAO P E，CHACON J L，et al.Orchitis in roosters with reduced fertility associated with avian infectious bronchitisvirus and avian metapneumovirus infections [J].AvianDiseases，2007，51(4)：900-904.

[6]王竹伟.能蛋水平对北京油鸡后期繁殖性能的影响及睾丸基因表达谱的建立[D].兰州：甘肃农业大学，2011. WANG Z W.Effects of energy-protein levels on reproduction performance in late reproductive period of Beijing-You chickens and construction of gene-expression profiles in the testicular azoosperma[D].Lanzhou:Gansu Agricultural University,2011.(in Chinese)

[7]胡娟.北京油鸡精液品质遗传参数估计及相关候选基因的研究[D].北京：中国农业科学院，2010. HU J.Estimation of genetic parameters and association analysis of relevant candidate genes with semen quality in Beijing-You chicken[D].Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2010.(in Chinese)

[8]LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method [J].Methods，2001，25(4)：402-408.

[9]陈德宇，刘利敏，谢庆东，等.弱精症患者精子基因表达谱的建立及分析[J].癌变·畸变·突变，2009，21(4)：286-290. CHEN D Y，LIU L M，XIE Q D，et al.Construction and analysis of gene-expression profiles in the sperms of patients with asthenospermia[J].Carcinogenesis，Teratogenesis&Mutagenesis，2009，21(4)：286-290.(in Chinese)

[10]刘利敏.无精症精子mRNA和miRNA差异表达谱的构建与分析[D].汕头：汕头大学，2009. LIU L M.Generation and analysis of mRNA and miRNA differential expression profiles in sperm of patients with asthenospermia[D].Shantou：Shantou University，2009.(in Chinese)

[11]SAPIRO R，KOSTETSKII I，OLDS-CLARKE P，et al.Male infertility，impaired sperm motility，and hydrocephalus in mice deficient in sperm-associated antigen 6[J].MolCellBiol，2002，22(17)：6298-6305.

[12]刘克锋，王瑞，李锐，等.不育症患者精浆果糖水平测定[J].郑州大学学报，2009，4(3)：495-496. LIU K F，WANG R，LI R，et al.Determination of seminal fructose in patients with infertility[J].JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences)，2009，4(3)：495-496.(in Chinese)

[13]OSTERMEIER C，IWATA S，MICHEL H.Cytochrome c oxidase [J].CurrentOpinStructuralBiol，1996，6(4)：460-466.

[14]辛钟成，刘武江，田龙，等.老年人睾丸组织退化的基因表达谱研究[J].北京大学学报，2003，35(4)：364-368. XIN Z C，LIU W J，TIAN L，et al，Studies on the testis regression related gene profile in aged male[J].JournalofPedingUniversity(HealthSciences)，2003，35(4)：364-368.(in Chinese)

[15]胡士军，朱辉，杨增明.前列腺素D2及其受体与哺乳动物生殖[J].动物学杂志，2004，39(3)：91-96. HU S J，ZHU H，YANG Z M.Prostaglandin D2 and its receptor in mammalian reproductive system[J].ChineseJournalofZoology，2004，39(3)：91-96.(in Chinese)

[16]TOKUGAWA Y，KUNISHIGE I，KUBOTA Y，et al.Lipocalin-type prostaglandin D synthase in human male reproductive organs and seminal plasma [J].BiolReprod，1998，58(2)：600-607.

[17]GERENA R L，IRIKURA D，URADE Y，et al.Identification of a fertility-associated protein in bull seminal plasma as lipocalin-type prostaglandin D synthase [J].BiolReprod，1998，58(3)：826-833.

[18]DIAMANDIS E P，ARNETT W P，FOUSSIAS G，et al.Seminal plasma biochemical markers and their association with semen analysis findings [J].Urology，1999，53(3)：596-603.

[19]吴堃，李辉，朱卓立，等.Wnt2在肝细胞肝癌中的表达及对HepG2细胞增殖的影响[J].基础医学与临床，2013，33(6)：757-762. WU K，LI H，ZHU Z L，et al.Wnt2 expression in Hepatocellular Carcinoma and its inhibitory effect on the proliferation of HepG2[J].Basic&ClinicalMedicine，2013，33(6)：757-762.(in Chinese)

[20]MILLER J R，MILLER.TheWnts[J].GenomeBiol，2002，3(1)：3001.1-3001.15.

[21]戴爱玲.细胞周期调控因子的研究进展[J].龙岩师专学报，2002，20(3)：53-54. DAI A L.A review of research progress of cell cycle modulators[J].JournalofLongyanTeachersCollege，2002，20(3)：53-54.(in Chinese)

[22]俞作仁.小鼠精子发生不同阶段生精细胞基因表达谱的研究[D].北京：中国协和医科大学，2003. YU Z R.Gene expression p rofiles in dieffrent stages of mouse spemratogenie cells during spemratogenesis[D].Beijing：Peking Union Medical College，2003.(in Chinese)

(编辑郭云雁)

The Expression of the Six Candidate Genes for Asthenospermia of the Rooster

FU Li1，2，SUN Yan-yan2，XUE Fu-guang2，LIU Ran-ran2，BAI Hao2，CHANG Guo-bin1，CHEN Guo-hong1，CHEN Ji-lan2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.NationalKeyLaboratoryofAnimalResourcesandGermplasmInnovation，InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

To explore the pathogenesis of the rooster asthenospermia，the expression profiles of 6 candidate genes (COX7B，PTGDS，hPGDS，SPAG6，WNT2 andCCNF) selected from the previous digital gene expression profiling (DGE) and bioinformatics analysis，were analyzed.A total of 300 Beijing-You roosters of 42 weeks were detected for 4 weeks for semen quality including semen volume，sperm mobility，etc.Fifteen asthenospermia and 15 normal roosters were selected accordingly.Real-time quantitative PCR were performed to determine the expression of the 6 genes in the testicular of those roosters.The results indicated thatCOX7BandPTGDSwere significantly high-expressed in the asthenospermia group (P<0.01)，while theWNT2，hPGDSandCCNFwere significantly low-expressed in the asthenospermia group (P<0.05).However，the expression ofSPAG6 gene was not significantly different in the 2 groups.These results were in accordance with the previous DGE analysis.The expression patterns of the 6 genes identified from DGE for asthenospermia in chickens were validated in the present study.They can be important candidate genes for further functional study and revealing the mechanism of chicken asthenospermia.

asthenospermia；candidate gene；testis；digital gene expression profiling；RT-qPCR

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.003

2014-08-15

国家自然科学基金(31372304)；中国农业科学院科技创新工程(ASTIP-IAS04)

富丽(1988-)，女，山东烟台人，硕士，主要从事家禽分子遗传研究，Tel：010-62816005，E-mail：momomook@126.com

*通信作者：陈继兰，研究员，E-mail：Chen.jilan@163.com

S831；S813.3

A

0366-6964(2015)06-0889-07