传染性支气管炎病毒S1和N基因遗传变异频率的分析

盛晓丹，徐怀英，刘 霞，黄迪海，曲新泽，秦卓明1，*

(1.山东省农业科学院家禽研究所，济南 250100；2.山东省健牧生物药业有限公司，济南 250100)

传染性支气管炎病毒S1和N基因遗传变异频率的分析

盛晓丹1，2#，徐怀英1#，刘 霞2，黄迪海2，曲新泽2，秦卓明1，2*

(1.山东省农业科学院家禽研究所，济南 250100；2.山东省健牧生物药业有限公司，济南 250100)

旨在探讨中国北方地区传染性支气管炎病毒(IBV)的流行和分子变异，进而探讨IBV的遗传演变规律。利用生物信息学方法对IBV纤突蛋白(S1)和核蛋白(N)编码基因进行分析比较。结果显示：2012—2013年发生在山东、天津等北方地区的IBV流行株高度同源，其S1基因核苷酸(氨基酸)相似性为94.0%～100%(93.1%～100%)，N基因为98.4%～99.1%(98.1%～99.8%)，而与经典疫苗株H120相似性均较低，且至少在S1基因的3个高变区产生了较多的点突变、缺失和插入，且变异集中在第53—150和250—290位，以高变区HVR I居多，GM/13在 62—65位缺失4个氨基酸。进一步的分析表明：IBV流行株S1基因与1998年在我国北方流行的A2株核苷酸相似性最高，为94.9%～97.2%，年核苷酸(nt)变异频率平均为2.4 nt×10-3；而N基因则与LX4株相似性最高，为93.0%～93.5%，年变异频率平均为5.1 nt×10-3。IBV流行株可能是A2-like和LX4-like毒株的重组，且N基因的变异频率明显高于S1基因。

IBV；S1基因；N基因；遗传变异频率

传染性支气管炎(infectious bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)引起的发生于鸡的一种急性、高度接触性呼吸道疾病，主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。IBV属于冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链RNA，约27 kb[1]。

IBV含有3种主要结构蛋白，即纤突蛋白(spike，S)、膜蛋白(membrane，M)和核蛋白(nucleocapsid，N)[2]。S蛋白位于IBV囊膜，由S1和S2两个亚单位组成[3]，编码540个氨基酸，可诱导机体产生中和抗体和血凝抑制(haemagglutination inhibition，HI)抗体[4]，是IBV基因组中最重要和最易发生变异的部位[5]。研究表明，S1基因同源性越低，交叉保护越差[6-8]。N蛋白位于病毒内部，常与RNA结合构成螺旋状核衣壳。早期认为N蛋白在IBV的进化过程中保守，但近年来的研究表明，N基因亦存在广泛的变异。

本研究对2012—2013年在中国北方地区分离的IBV进行分离鉴定，克隆其S1和N基因，综合前期研究的结果，与国内外经典IBV疫苗株进行同源性比较分析，绘制系统发育树，并首次对其核苷酸变异频率进行分析比较。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 从辽宁、天津、山东等多个疑似感染IBV的鸡群中，采集气管、肾和肺等组织，按常规通过SPF鸡胚进行病毒分离鉴定，获得13株IBV(表1)。

1.1.2 主要试剂 RNAiso Plus、M-MLV、RNA酶抑制剂及dNTP混合物、TaqDNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。SPF鸡与鸡胚由山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡场提供。

1.2 动物回归试验

选取不同地域有代表性的4株IBV分离株TJ-1/13、GM/13、LY-1/13和LY-3/13，按1∶10稀释，分别通过滴鼻点眼途径接种10只7 d SPF鸡，每只0.1 mL，同时设SPF鸡对照10只，观察14 d，记录实验鸡发病情况。

表1 IBV病毒分离时间和临床病变

Table 1 Main IBV isolates and pathogenicity listed in different time and fields

毒株Strains分离年Year分离地点Location缩写Abb.临床病变PathogenicityCKSDXT20122012烟台YantaiXT/12NephritisCKSDZL20122012潍坊WeifangZL/12NephritisCKSDMH20122012潍坊WeifangMH/12NephritisCKSDFX20122012威海WeihaiFX/12NephritisCKTJ-220122012天津TianjinTJ-2/12NephritisCKTJ-320122012天津TianjinTJ-3/12NephritisCKTJ-120132013天津TianjinTJ-1/13NephritisCKTJ-220132013天津TianjinTJ-2/13NephritisCKHBCZ20122012沧州CangzhouCZ/12NephritisCKLNLY-120132013辽阳LiaoyangLY-1/13NephritisCKLNLY-220132013辽阳LiaoyangLY-2/13NephritisCKLNLY-320132013辽阳LiaoyangLY-3/13NephritisCKSDGM20132013潍坊WeifangGM/13Nephritis

1.3 引物设计

参照GenBank已公布的IBV基因组S1和N基因序列，利用Primer primier5.0设计2对引物，引物由上海生物工程有限公司合成。S1和N基因扩增产物分别为1 783和1 488 bp。S1-F：5′-GCA-ACGCCAGTTGTTAATTTG-3′，S1-R：5′-CAG-CTTTAACGAACCATCTGG-3′；N-F：5′-AGCA-ATAGCAAGAAAAGCGC-3′，N-R：5′-GCACAT-AATCACAATCAATGCC-3′。

1.4 RT-PCR扩增与测序

按RNAiso Pus说明书从尿囊液中提取病毒RNA，通过RT-PCR扩增S1和N基因。程序：42 ℃反转录30 min，94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s，35个循环；最终延伸10 min。将经过电泳鉴定的PCR产物送往北京六合华大公司测序。

1.5S1和N基因同源性比较、系统发育分析和核苷酸变异频率分析

2 结 果

2.1 病毒的分离鉴定

2012—2013年在北方发生的IBV，临床发病以肾的病变为主，呼吸道症状轻微，主要病变为肾肿胀、淤血，并伴有不同程度的尿酸盐沉积。经SPF鸡胚传代，大多数IBV毒株尽管第1代未出现病症，但在第2代以后陆续出现了典型的“侏儒胚”变化：个体发育较小，头、爪合抱在一起，鸡胚蜷缩，活性较差。取鸡胚尿囊液分别进行IBV特异性RT-PCR检测和HA检测。结果HA检测阴性，均扩增出IBV目的片段。

2.2 动物回归试验

在SPF鸡接种4种IBV分离毒2～3d后，攻毒组均出现甩鼻、咳嗽等呼吸道症状，死亡率在不同毒株间有差异，TJ-1/13、GM/13、LY-1/13和LY-3/13死亡鸡只分别为3、6、4和2。以GM/13死亡最多，60%死亡，LY-3/13最少，仅20%死亡。死亡鸡与临床发病鸡群剖检症状相同，表现为输尿管尿酸盐沉着，肾大并伴有尿酸盐沉积，发病鸡脱水严重。未攻毒组SPF鸡生长发育正常。

2.3 测序结果

13株IBVS1基因核苷酸(nt)为1 720bp，4株N基因为1 440bp，分别编码540和409个氨基酸(aa)。

2.4 S1基因同源性比较和分子特征分析

13株IBV流行株之间S1核苷酸(氨基酸)序列相似性为94.0%～100%(93.1%～100%)；与1998年在北方流行的A2毒株nt(aa)相似性最高，为94.9%～97.2%(94.6%～96.6%)；与LX4的nt(aa)相似性仅为93.1%～94.2%(92.5～94%)；而与经典疫苗株H120的S1nt(aa)相似性不足74%(75%)。

以中国常用疫苗株H120、M41和欧洲疫苗株4/91为参照，对我国IBV主要流行株进行氨基酸变异位点分析(表2)。11株IBV流行株S1蛋白氨基酸的突变主要集中在第53—150和250—290位。此外，在多处发生明显的点突变，其中LY-3/13、GM/13、LY-1/13在第56—69位的变异最大，且GM/13在62—65位缺失4个氨基酸。GM/13、LY-1/13与TJ-1/13的S蛋白切割识别位点均为HRRRR，而LY-3/13则为HRCRR。

比较还证实：同一基因型毒株氨基酸替代较一致，如在53位点，Mass-like毒株均为异亮氨酸(I)，4/91-like毒株均为缬氨酸(V)，SD-like与A2-like毒株均为色氨酸(S)；而不同基因型的IBV毒株氨基酸则有较大差异，如在56位点，Mass-like毒株为谷氨酸(E)，4/91-like毒株为色氨酸(G)，SD-like毒株为赖氨酸(K)，而A2-like毒株为组氨酸(H)或酪氨酸(Y)。值得关注的是，有些位点的氨基酸为不同分支毒株所共有，如在62位点Mass-like、4/91-like与A2-like毒株均为S；而1997—1999年的3个山东毒株SD-B-97、SD-D-98、SD-HD-99等在相同位点均为苏氨酸(T)，反应出毒株之间的内在联系性，同时显示出毒株的特异性。

2.5 系统发育

根据IBVS1基因的核苷酸序列同源性可将IBV至少分为八大类，包括A2-like、4/91-like、Mass-like、Conn-like、T-like等(图1)，其中，13株2012—2013年在北方分离的IBV流行株与A2株系统发育关系最密切，而与疫苗株H120、H52、M41、4/91等遗传关系相对较远。

2.6N基因同源性比较和系统进化

4株IBV流行株N基因之间核苷酸(氨基酸)相似性较高，为98.4%～99.1%(98.8%～99.8%)，但与经典疫苗株H120的相似性相对较低，为85.7%～86.4%(91.0%～91.7%)，表现出明显差异。对4株IBV分离株的N基因序列进行分析，结果发现无碱基的缺失和插入，但存在点突变，且N基因存在广泛的氨基酸替代，变异主要集中在179-236、340-370位碱性氨基酸区。系统进化见图2。

2.7 1998—2013年中国北方地区IBVS1和N基因的核苷酸变异频率

由同源性比较可知，IBV流行株在S1基因与我国1998年在北方最早流行的A2同源性最高，核苷酸相似性为94.9%～97.2%，而与LX4的相似性仅为93.4%～95.4%。以A2为参考毒株，则发现1998—2013年间IBV流行株S1基因的核苷酸年平均变异频率为2.4×10-3(表3)。

2013年4株IBV流行株在S1基因与我国1998年A2株核苷酸相似性最高，为95.6%～97.2%；与我国1999年在北方最早流行的LX4的相似性为94.7%～96.1%；相应的N基因则与LX4核苷酸相似性最高(93.2%～93.8%)，与A2的相似性仅为90.4%～90.6%(表4)。结合IBV属于冠状病毒，具有“跳跃式复制”的特点，且校对机制不完善的特点，推测IBV分离株在流行过程中可能存在A2-like和LX4-like毒株之间的重组。

以LX4为参考毒株，则发现1999年以来，IBV流行株N基因的核苷酸年平均变异频率为5.1×10-3，明显高于S1基因(表5)。

表3 1998—2013年间IBV流行株S1基因的核苷酸变异频率

Table 3S1 gene mutation frequency of IBV isolates from 1998 to 2013

毒株Strain分离年Yearofisolationnt变异数量Variationnumberofnt转换(P)Transition颠换(Q)Transversion变异频率Mutatonfrequency年平均变异率(×10-3)Mutationfrequencyperyear(×10-3)A219980000TJ-3/1220124834140.035TJ-2/1320134932170.037TJ-2/1220124834140.035TJ-1/1320134932170.037ZL/1220125033170.037XT/1220125033170.037MH/1220126542230.049GM/132013453690.031FX/1220125035150.037LY-3/132013322880.025LY-2/1320136141200.045LY-1/1320136141200.045CZ/1220124932170.0372.4(1.6～3.3)

表4 2013年IBV分离株S1和N基因与A2、LX4及其与疫苗株的核苷酸同源性比较

Table 4 Nucleotide acids homologies of IBV isolates in 2013 comparing with vaccine references

毒株StrainA2LX4H1204/91S1NS1NS1NS1NTJ-1/1396.890.495.393.678.287.178.987.6GM/1397.190.596.193.277.886.978.987.9LY-1/1395.690.694.793.877.487.578.488.1LY-3/1397.290.696.193.278.087.179.287.9

毒株名后是其GenBank登陆号；●表示本研究毒株。图2同GenBank No.were listed after the names of IBV；● indicates the used strain in this study.The same as below图1 13株IBV分离株与参考株S1基因核苷酸序列系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of the S1 gene from the 13 IBV isolates in this study and the reference strains

图2 4株IBV分离株与参考株N基因核苷酸序列系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of the N gene from the 4 IBV isolates in this study and the 22 reference strains

3 讨 论

我国IBV流行株血清型和基因型均比较复杂，世界上不同血清型和基因型的IBV株几乎均可在我国分离到。正是由于IBV存在不同种类的基因型，导致其抗原性多种多样，进而导致IBV免疫失败不断发生，给养禽业造成了巨大的经济损失[10-12]。本研究自2012年初陆续从我国辽宁、天津、山东等北方地区分离到13株IBV，筛选出4株IBV进行动物回归试验，证实均可引起鸡呼吸道和肾的病变。序列分析表明，IBV流行株与H120等Mass型经典疫苗株及新型疫苗4/91株相比，均有较大的差别(分属于不同的基因型)。

对IBVS1基因大量的研究表明：该基因一般存在3个高变区(HVR)，分别位于第3—25、52—154和266—294，而这些位点通常与IBV决定抗原性的中和抗体位点密切相关[13]。本研究分离的13株IBV流行株的S1变异位点恰好集中在第53—150和250—290位，提示IBV毒株的分子变异可能是导致IBV抗原性变异的重要基础，也是疫苗在我国免疫失败的主要原因[14]。

表5 1999—2013年IBV流行株N基因的核苷酸变异频率

Table 5Ngene mutation frequency of IBV isolates from 1999 to 2013

毒株Strain分离年Yearofisolationnt变异数量Variationnumberofnt转换(P)Transition颠换(Q)Tranversion变异频率Mutationfrequency年平均变异率(×10-3)Mutationfrequencyperyear(×10-3)LX419990000TJ-1/1320137859190.076GM/1320138262200.080LY-1/1320137557180.072LY-3/1320138260220.0815.1(4.8～5.4)

研究表明，IBV的N基因富含碱性氨基酸，相对保守，这一结果有利于N蛋白与核酸的结合，但已有报道证实N基因也存在不同程度的变异[15-16]。本试验证实，4株IBV分离株N基因与H120相比，核苷酸(氨基酸)相似性不足87%(90%)，变异主要以点突变为主，无核苷酸的插入和缺失，其中在179—236位、340—370位碱性氨基酸区域变异较大。该氨基酸残基位于第一个线性B细胞抗原表位(175—241位)[17]、CTL的抗原表位(290—409位)[18]和线性B细胞抗原表位(310—370位、360—409位)区域内，而这种变异往往会改变病毒诱导的宿主B淋巴细胞的反应性。

IBV基因组为不分节段的正股单链RNA，具有特殊的转录机制，在先导RNA序列与基因内部起始位点之间有7～18个核苷酸是相同的，且RNA聚合酶沿着模板“跳跃前进”，这正是导致IBV具有较高重组率的重要原因，也是促成IBV发生自然突变的原因之一[19-20]。本研究分离鉴定的4株IBV，其S1基因与A2株相似性最高，而其N基因则与LX4株最高，由此推断IBV分离株可能是A2-like和LX4-like类型毒株在S1和N基因层面上的重组，有待通过实验室进一步证实[20]。此外，综合本实验室近二十年对IBV的研究结果，首次对其S1和N基因的核苷酸变异频率进行统计学比较，计算出了IBV在不同年代的基因变异频率。上述工作有待进一步深入研究。

尽管中国IBV十分复杂，但其变异有着十分明显的“时间和地域性”特点。本研究分离到的13株IBV高度一致，且与1998年在我国北方发生的A2-like类型毒株密切相关，而与欧洲株4/91-like明显不同，是中国所特有的毒株[21-22]。因此，应加强对IBV流行株的跟踪研究，研制合适的疫苗，这对合理防控IB意义重大。

4 结 论

IBV流行株是A2-like和LX4-like在S1和N基因层面上的重组。在近十年，IBV流行株N基因的核苷酸年平均变异频率为5.1×10-3，明显高于S1基因的变异频率(2.4×10-3)。

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(编辑 白永平)

Genetic Variation Frequency ofS1 andNGene of Infectious Bronchitis Virus

SHENG Xiao-dan1，2#，XU Huai-ying1#，LIU Xia2，HUANG Di-hai2，QU Xin-ze2，QIN Zhuo-ming1，2*

(1.InstituteofPoultryScience，ShandongAcademyofAgriculturalScience，Jinan250100，China；2.ShandongJianmuBiologicalPharmaceuticalCo.，Ltd.，Jinan250100，China)

This study was undertaken to investigate the prevalence and molecular variation of infectious bronchitis virus in the northern area of China.Thirteen infectious bronchitis viruses (IBV) strains obtained from commercial chickens in northern China between 2012 and 2013 were isolated and identified by the sequencing of the entireS1 gene.The variants were distinguished by phylogenetic analysis and alignment in comparison with the vaccination-challenge tests that were performed using heterogeneous strains.The results showed that both theS1 andNgene of the prevailing IBV shared higher homologies.Furthermore，S1 gene shared nucleotide (amino acid) homology of 94.0%-100% (93.1%-100%)，andNgene had nucleotide (amino acid) 98.4%-99.1% homology (98.1%-99.8%)，receptively.Compared with the classical vaccine strain，there were at least three hyper-variable regions were found inS1 gene，and point mutations，deletions and insertions of IBV strains were also occurred at the genomic level，which were concentrated in the 53-150，and 250-290.Four amino acids were found missing in GM/13 at 62-65.Further analysis showed that the IBV epidemic strains shared highest homology (94.9%-97.2%) with A2 strains and the nucleotide (nt) mutation frequency averaged 2.4 nt×10-3/year in view ofS1 gene；while，theNgene was the LX4 strains of the homologous highest (93.0%-93.5%)，the average annual variation in frequency 5.1 nt×10-3/year.Those findings suggest that the recent IBV epidemic strains may be recombinant of A2 and LX4 type strains，andNgene mutation frequency is greater than of theS1 gene.

infectious bronchitis virus；S1 gene；Ngene；mutation frequency

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.015

2014-09-24

国家自然科学基金(31372332)；科技部农转资金(SQ2013ECC600059)；山东省科技攻关重点支持项目(2009GG10009006)；济南市成果转化支持项目(2012CG92)

盛晓丹(1985-)，女，山东潍坊人，助理研究员，主要从事动物传染病防控研究，E-mail：sxd1985wl@163.com；徐怀英(1976-)，女，山东冠县人，副研究员，主要从事动物传染病和免疫学研究，E-mail：hyingxu@163.com。二人对本文同等贡献

*通信作者：秦卓明，E-mail：qinzm1997@163.com

S852.659.6

A

0366-6964(2015)06-0989-09