胶体金法检测HIV抗体质控血清的制备及应用

祝 颖，宋小妮

（正安县疾病预防控制中心，贵州遵义563400）

胶体金法检测HIV抗体质控血清的制备及应用

祝 颖，宋小妮

（正安县疾病预防控制中心，贵州遵义563400）

目的 制备适合胶体金法检测人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体的质控血清，以监控胶体金试剂的质量变化和检验过程中各种因素对检测结果的影响。方法 用健康人（肝炎标志物和HIV抗体均阴性）血清倍比稀释经确证的HIV抗体阳性者血清。结果 在环境温度15～30℃，根据阳性血清浓度选择稀释0～16倍的血清作为胶体金试剂的质控血清，试验5min能均一稳定显色判读结果。结论 胶体金法检测HIV抗体快速、简便，可单份测定，试剂易于保存，但易受检测温度和时间的影响，需做好室内质量控制才能避免后带现象出现和弱阳性漏检。

HIV； 胶体金； HIV抗体； 免疫血清； 血液稀释； 质量控制

艾滋病是一种严重破坏人体免疫系统，使感染者易患机会性感染或肿瘤而丧失劳动力直至死亡的重大传染病。随着我国各项艾滋病防治措施的有效落实，疫情的上升速度有所减缓，2009年全球艾滋病流行报告显示，我国目前存活的艾滋病病毒感染者和患者约74万，但只有不到1/3的感染者得到了诊断[1]，还有很多感染者和患者没有被发现，其在不知道自己感染人类免疫缺陷病毒（HIV）的状况下将病毒传播给配偶或他人，易导致更广泛的流行传播。因此，扩大检测范围，推广HIV抗体快速检测，最大限度地尽早发现感染者并实施治疗成为艾滋病防治的主要策略之一[2]。胶体金法作为HIV快速检测的方法之一，不需要贵重的实验设备和专门的实验室，可用全血（指血），不需要离心，结果易解释，更适合急诊患者、孕产妇、求询者、职业暴露等人员快速取得检测结果[3]。胶体金试剂的检测结果易受环境温度和操作人员操作技能的影响而出现变化，所以，制备质控血清有利于提高检测的准确性和可靠性。现将胶体金法检测HIV抗体质控血清的制备方法介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 A试剂：珠海丽珠HIV（1+2型）抗体第三代酶联试剂；B试剂：珠海丽珠胶体金试剂盒；C试剂：北京万泰胶体金试剂盒。试剂均在有效期内，经国家批批检验合格。

1.1.2 仪器 生物安全柜、离心机、移液器、安图酶标仪2010、安图洗板机fludio、计时器等。

1.2 方法

1.2.1 原始质控血清收集 用无菌血清管分别收集经免疫印迹试验确证的HIV抗体阳性者血清（蛋白条带齐全）作为原始阳性血清和HIV抗体阴性的健康人血清作为稀释血清。所有血清要求外观无溶血、脂血、黄疸，无细菌污染，肝炎标志物和类风湿因子均阴性。

1.2.2 阳性血清处理 将收集的阴、阳性血清用离心机3 000 r/min离心15min去除蛋白质沉淀，56℃加热30min灭活处理[4]。

1.2.3 阳性血清检测 将已处理好的阳性血清用A试剂按照说明书进行双孔检测取其S/CO均值，实验在A试剂的质控范围内方有效。

1.2.4 质控血清的制备 在生物安全柜内，根据阳性血清S/CO分别选择强阳、中值阳、弱阳3个浓度用阴性血清按1∶1至1∶32倍比稀释，反复混匀[5]。

1.2.5 质控血清检测 将胶体金试剂平衡至室温（15～30℃），分别取50μL制备好的各稀释度血清和稀释液加在加样区，30min内判读结果。试验一直进行到使胶体金试剂不显色的稀释度为止，同时记录胶体金试剂均一、稳定显色的时间。同一稀释度做2～3个平行试验观察重复性。

2 结 果

2.1 敏感性测定 各浓度不同稀释倍数血清在20℃、试验5min的结果见表1。

表1 各浓度不同稀释度血清检测结果

2.2 最佳检测温度及时间 检测温度在15～30℃时，各稀释度血清在胶体金试剂上5min均能稳定显色，但强阳性血清稳定显色的时间约10 min。当温度高于35℃时，高、低浓度血清均瞬间出现强阳性，阴性血清仍为阴性。

2.3 分装、保存 经上述步骤，选择强阳性血清1∶16稀释、中值阳性血清1∶4稀释、弱阳性血清不稀释作为日常检测的质控血清。按每周使用量为每管300μL进行分装，置-20℃冰箱保存待用，尽量减少反复冻融，防止弱阳性质控血清滴度下降变为阴性[6]。

2.4 稳定性测定 稳定性是质控品最重要的特性，如果质控品缺乏应有的稳定性，就失去了做质控的意义[7]。将上面筛选所得的3种自制质控血清复融保存于4℃冰箱1～7 d，每天分别用B、C试剂检测。结果显示，自制质控血清用2个厂家胶体金试剂检测稳定性、重复性均较好，见表2。

表2 自制质控血清复融后7 d检测结果

3 讨 论

近年来，国产HIV抗体快速诊断试剂的质量不断提高，经国家艾滋病检测试剂临床质量评估，大多数快速检测试剂的敏感性、特异性、功效率与进口试剂已无明显差别，个别还好于进口试剂，甚至接近或达到了酶联试剂的质量标准要求。胶体金检测HIV抗体简便快速、易操作、结果判定直观，但也有其局限性，当检测样品中含有特异性干扰物（类风湿因子、结合蛋白、嗜异性抗体、人抗动物抗体和药物及其代谢物等）[8]和较高的三酰甘油或大量溶血时，会影响到样品及胶体金在硝酸纤维膜上的层析，可能出现错误的检测结果[5]。

室内质控是实验室获得可靠测定结果的关键，决定着实验的可重复性、精密度[9]。实际工作中，多数实验室人员普遍将试剂“对照线”作为质控线，基本不用质控血清做室内质控。事实上，“对照线”是游离的胶体金标记重组Au-HIV1/2-Ag和HIV多克隆抗体结合而富集显色，不需要待测物的参与，只能作为实验成功与否或检测试剂是否失效的参考指标，并不能反映试剂检测HIV抗体的敏感性、特异性、重复性等质量指标。灵敏度的变化最容易观察，所以，可将敏感性检测作为室内质控的主要途径。无论是不同厂家的试剂或同一厂家不同批次的试剂，都应在检测前每天用质控血清检测其敏感性，确保当天检测结果的准确有效，对重复检测2次均阳性的样品需用ELISA复检，当ELISA复检阳性，则需经Western blooting确证。由于各地HIV快速检测点发现的阳性样品都必须送往上级实验室复检，不易获得经确证的HIV抗体阳性血清，故胶体金法检测HIV抗体的质控血清最好由确证实验室或筛查中心实验室制备并分发给筛查点。由于不同厂家胶体金试剂所用抗原不尽相同，制备质控血清最好选择蛋白条带齐全的阳性血清，不能用ELISA试剂盒中的阳性对照稀释制备。阴性稀释液选用健康人群HIV抗体阴性的血清，而不用小牛血清、PBS和生理盐水，是为了保证质控血清中的蛋白质处于天然的浓度和状态，与检测样本处于同一体系，更有利于质控[10]。

总之，胶体金检测HIV抗体有优势，也有不足，总体上利大于弊。通过做好质控血清的应用，加强实验人员的操作技能和责任心，严格按照试剂说明书进行实验，避免误判、漏判，可广泛推广应用于我国基层医疗卫生机构，增加自愿咨询检测（VCT）覆盖面，降低VCT成本[11]，以尽早发现更多的隐性感染者，对其有效管理提供技术支持。

[1]联合国艾滋病规划署.2009年全球艾滋病流行报告[EB/OL].（2009-11-24）[2014-08-21].http：//www.unchinaids.org.cn/n16/n1058/297763.html.

[2]邢文革，蒋岩.HIV抗体快速检测试验的临床应用[J].中华医学实践杂志，2005，4（1）：24-26.

[3]韦兴强，韦东禄，邱涛.HIV抗体快速检测现状及其推广应用[J].中国保健营养，2012，14（9）：3561-3562.

[4]中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范（2009修订版）[M].北京：中国疾病预防控制中心，2009：1-81.

[5]徐大叶，周克捷.艾滋病实验室HIV抗体血清室间盲样考核的制备及分析[J].现代预防医学，2013，40（12）：2334-2336.

[6]杨万琴.HIV抗体外部质控血清制备的探讨[J].当代医学，2009，15（31）：154.

[7]芮桥安.血清免疫实验室弱阳性室内质控血清的制备及应用[J].昆明医学院学报，2012（1B）：296-297.

[8]李红宇，陶艳兵，汪安武，等.HIV初筛检测的室内质控结果分析[J].中国艾滋病性病，2013，19（5）：363-366.

[9]宫辉，高玲娟.抗HIV抗体弱阳性质控血清的制备及应用评价[J].中国卫生检验杂志，2014，24（21）：3092-3093.

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[11]冉艳红，李慧，孙江平，等.艾滋病自愿咨询检测进展与我国现状[J].中国艾滋病性病，2008，14（2）：204-206.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.09.039

B

1009-5519（2015）09-1376-03

2014-12-16）

祝颖（1979-），男，贵州遵义人，主管检验师，主要从事艾滋病监测、检测工作；E-mail：zhu-ying@163.com。