载药组织工程支架的构建及其性能研究

向柄彦，郭 元

（1.遵义市第一人民医院，贵州563000，2.玉田县医院，河北唐山641000）

载药组织工程支架的构建及其性能研究

向柄彦，郭 元

（1.遵义市第一人民医院，贵州563000，2.玉田县医院，河北唐山641000）

目的 构建含有万古霉素和重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）微球的组织工程支架，并研究其性能，为后期慢性骨髓炎的治疗奠定实验基础。方法 取壳聚糖溶液、纳米羟基磷灰石适当比例混合，倒入准备好的铸模槽，通过冻干技术与化学交联方法制备成固体材料，并置于含有rhBMP-2/聚乳酸（PLA）和万古霉素/PLA缓释微球溶液中，-80℃冷冻2 h后放入真空冷冻干燥机内干燥12 h，用60Co辐照消毒备用，并检测支架性能及万古霉素和rhBMP-2的释放效率，绘制释放曲线。结果 所构建的纳米羟基磷灰石/壳聚糖（n-HA/CS）支架孔径大小为80～270μm，平均146.53 μm；rhBMP-2/PLA和万古霉素/PLA缓释微球成团状均匀分布于载药支架的孔隙中；载药支架能够较稳定的释放万古霉素和rhBMP-2，持续时间约18 d，随着时间的延长释放量逐渐减少。结论 构建的载药组织工程支架具有良好的生物性能及释放效率，有望成为一种新型、优良的复合骨组织工程支架材料。

骨形态发生蛋白质类； 重组蛋白质类； 万古霉素； 迟效制剂； 微球体； 支架； 骨疾病

慢性骨髓炎骨缺损的治疗一直是困扰骨科医生的难题之一[1-2]。骨组织工程学研究的进步为慢性骨髓炎骨缺损的治疗带来了新思路、新方法，通过将细胞因子复合生物支架材料修复骨缺损载药组织工程支架已成为骨组织工程学研究的热点[3]。本实验使用聚乳酸（poly lactic acid，PLA）为缓释载体，采用复乳溶剂挥发法成功制备出的重组人骨形态发生蛋白2（recombinanthuman bonemorphogenetic protein-2，rhBMP-2）/PLA缓释微球和万古霉素/PLA缓释微球，并整合到纳米羟基磷灰石/壳聚糖（n-HA/CS）生物支架中，对其生物性能进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料 纳米羟基磷灰石、壳聚糖（山东潍坊市海之源生物公司）；万古霉素（韩国希杰有限公司）；冷冻干燥机（美国Thermo公司）；S-3400N扫描电镜（日立公司）；rhBMP-2（上海生工生物工程有限公司）；ATCC29210金黄色葡萄球菌由遵义市第一人民医院检验科惠赠。

1.2 方法

1.2.1 rhBMP-2/PLA和万古霉素/PLA缓释微球n-HA/CS生物支架的制备 根据Ma等[4]等方法将壳聚糖溶液、纳米羟基磷灰石适当比例混合，倒入准备好的铸模槽，通过冻干技术与化学交联方法制备成固体材料，并进入含有rhBMP-2/PLA和万古霉素/PLA缓释微球溶液中，-80℃冷冻2 h后放入真空冷冻干燥机内干燥12 h，用60Co辐照消毒备用。

1.2.2 载药组织工程支架的性能测定 采用扫描电镜检测观察空隙形貌，用万能材料试验机检测支架材料的抗压能力，观察是否符合实验要求。将制备成功的固体材料放置4℃冰箱保存。

1.2.3 载药组织工程支架的体外抑菌实验 将支架材料置于接种金黄色葡萄球菌的琼脂固体培养基中，37℃恒温培养箱培养24 h，用卡尺测量抑菌的范围，取出支架材料重新置于接种金黄色葡萄球菌的琼脂固体培养基中。以后每2天测量1次抑菌范围并更换培养基，直至不再出现抑菌圈。

1.2.4 缓释微球万古霉素及rhBMP-2释放效率的测定 称取10mg rhBMP-2/PLA和万古霉素缓释微球溶于适量双蒸水，每隔2 d用ELISA法测定溶液中rhBMP-2和万古霉素的浓度，并每2天移去原溶液50%溶液，并用无菌PBS补充至原量。根据测定值绘制释放曲线。

2 结 果

2.1 支架材料的电镜扫描及生物力学测试 支架材料经电镜扫描后呈现出丰富的不规则多孔结构，各孔之间相通性好，孔径大小为80～270μm，平均孔径为146.53μm。见图1。

图1 支架材料电镜扫描

2.2 缓释微球整合情况观察 扫描电镜下观察发现，rhBMP-2/PLA和万古霉素/PLA缓释微球均匀紧密地黏附在n-HA/CS支架的孔隙中，部分缓释微球成团状分布。见图2。

图2 载药组织支架材料的电镜扫描

2.3 载药支架材料的体外抑菌性能 载药材料在体外能有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，其抑菌作用持续25 d；随着时间推移，抑菌范围不断缩小。见图3。

2.4 万古霉素/PLA、rhBMP-2/PLA释放效率 万古霉素/PLA和rhBMP-2/PLA均可持续缓慢释放，其持续时间可达18 d，随着时间的延长释放量逐步下降。见图4。

图3 载药支架材料体外抑菌性能

图4 万古霉素/PLA、rhBMP-2/PLA释放效率测定

3 讨 论

慢性骨髓炎的治疗是骨科疾病的难题。近年来，随着抗生素的不断升级及骨科诊疗技术的不断进步，临床对骨髓炎的治愈率不断提高，但治疗效果仍不理想。目前慢性骨髓炎的治疗主要包括彻底清创、持续冲洗及抗生素的应用[5]。抗生素的长期应用存在多种不良反应，如胃肠道反应、耳毒性、肾毒性及骨髓抑制等。研究表明，局部应用抗生素可达到有效浓度并减轻不良反应。最早应用于临床的载药植入材料是一种聚甲基丙烯酸甲酯，其植入体内后会放热，单体成分对人体具有毒性，组织相容性差，需二次手术取出，患者创伤及经济负担重，限制了其临床应用[6-7]。因此，研发新的局部抗生素缓释系统，可为慢性骨髓炎提供新的治疗方案。

作为骨组织工程理想支架材料应当具有很好的生物相容性、可降解性及适宜的机械强度等。壳聚糖、羟基磷灰石均为天然材料，具有良好的生物相容性，但单独应用制成支架均存在一定的缺陷。叶鹏等[8]将丝素蛋白、壳聚糖、纳米羟基磷灰石通过冷冻干燥法与化学交联技术制备成生物支架，其相关检测达到骨组织工程支架的基本要求。rhBMP-2是经实验证实的最重要的骨诱导因子，是控制骨缺损修复信号通路的必需成分，是目前骨组织工程研究最多和应用最广泛的生长因子[9-10]。但因其半衰期短，在局部组织中易被降解或在体液中快速扩散，难以在骨缺损部位持续诱导成骨[11]。因此，构建能够持续释放rhBMP-2的缓释系统对骨缺损修复具有重要意义。

PLA具有良好的生物相容性及可降解性，最终代谢产物为水和二氧化碳，是美国食品药品管理局（FDA）批准应用的医疗高分子可降解材料。目前应用PLA作为缓释载体制备的化疗药物、激素、胰岛素、抗生素等缓释药物取得了良好疗效，部分已应用于临床[12-14]。鉴于上述优点，本课题选用PLA作为rhBMP-2的缓释载体，通过制作符合生物力学要求的生物工程支架材料，并负载万古霉素和rhBMP-2，使其在体内缓慢释放，达到局部有效浓度，为慢性骨髓炎的治疗和骨愈合提供良好环境。

综上所述，本研究构建的载药组织工程支架材料具有良好的生物学性能，其载药释放效率高、时间长，有望成为一种新型、优良的复合骨组织工程支架材料。

[1]Huang HK，Chiang CC，Su YP，etal.Role ofautologousbone graft in the surgical treatmentofatrophic nonunion ofmidshaftclavicular fractures[J]. Orthopedics，2012，35（2）：e197-201.

[2]杨大志，罗惠莉，易伟宏，等.骨形态发生蛋白-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料修复颅骨缺损[J].中华实验外科杂志，2012，29（7）：1250-1253.

[3]黄江鸿，王大平，刘建全，等.新型聚乳酸与纳米羟基磷灰石复合人工骨的性能测试研究[J].中国临床解剖学杂志，2012，30（3）：324-328.

[4]Ma T，Shang BC，Tang H，etal.Nano-hydroxyapatite/chitosan/konjac glucomannan scaffolds loaded with cationic liposomal vancomycin：preparation，in vitro release and activity against Staphylococcus aureus biofilms[J]. JBiomater SciPolym Ed，2011，22（12）：1669-1681.

[5]Hatzenbuehler J，Pulling TJ.Diagnosisandmanagementofosteomyelitis[J]. Am Fam Physician，2011，84（9）：1027-1033.

[6]黄金亮，马涛，唐辉，等.万古霉素阳离子脂质体复合纳米羟基磷灰石/壳聚糖/魔芋葡甘聚糖治疗兔慢性感染性骨缺损[J].中国修复重建外科杂志，2012，26（2）：190-195.

[7]王翔宇，刘强，卢向东，等.转基因干细胞复合纳米羟基磷灰石胶原/聚乳酸修复骨缺损的实验研究[J].中国药物与临床，2012，12（7）：857-860.

[8]叶鹏，田仁元，黄文良，等.丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石构建的骨组织工程支架[J].中国组织工程研究，2013，17（29）：5269-5274.

[9]许锋，詹玉林，宋兴华.骨形态发生蛋白2基因治疗骨缺损研究进展[J].医学综述，2012，18（11）：1612-1614.

[10]Rey-Rico A，SilvaM，Couceiro J，etal.Osteogenic efficiency of in situ gelling poloxamine systemswith and withoutbonemorphogenetic protein-2[J]. EurCellMater，2011，21：317-340.

[11]Schmidmaier G，Schwabe P，Strobel C，etal.Carrier systemsand application of growth factors in orthopaedics[J].Injury，2008，39 Suppl 2：S37-43.

[12]李湘南，陈晓明，彭志明，等.纳米羟基磷灰石/壳聚糖载药微球的制备及性能[J].中南大学学报，2012，42（5）：1232-1237.

[13]马爱洁，张玉祥，陈卫星.复相乳液法制备聚乳酸/胰岛素缓释微胶囊[J].西安工业大学学报，2009，29（4）：341-344.

[14]樊国栋，张春梅.聚乳酸在医学领域应用研究进展[J].科技导报，2010（19）：103-107.

Establishmentofdrug-loaded tissueengineering scaffoldsand itsproperties

Xiang Bingyan，Guo Yuan
（1.The FirstPeople′s Hospitalof Zunyi，Guizhou 563000，China；2.Yutian County Hospital，Tangshan，Hebei641000，China）

Objective To establish tissue engineering scaffolds containing vancomycin and rhBMP-2microspheresand investigate its performance，which providesexperimentalbasis for the treatmentof later chronic osteomyelitis.M ethods The chitosan solution and nano hydroxyapatite weremixed in appropriate proportion，and then poured into themould slot prepared by freeze-drying technique and chemical cross-linking method for preparing solid material and turned into solution containing rhBMP-2/PLA polylactic acid and vancomycin/PLA releasemicrospheres.After frozen in-80℃for 2 h and then put into the vacuum freeze drier to dry for 12 h，sterilized with60Co irradiation for preparation，the release efficiency detection support performance and vancomycin and rhBMP-2，itwas detected scaffolds performance and release efficiency of vancomycin and rhBMP-2 microspheres aswellas drawing the release curve.Results The pore size of n-HA/CSscaffolds in this study was 80-270μm，with an average of 146.53μm.The rhBMP-2/PLA and vancomycin/PLA sustained releasemicrosphere were distributed in the gaps of drug-loaded scaffolds inmolding.The drug-loaded scaffoldswas available to release rhBMP-2 and vancomycin steadily，lasting about18 d.with the time prolonged，the release amountdecreased.Conclusion The drug-loaded tissue engineering scaffolds containsa good biologicalproperties and release efficiency，being expected to become a new and fine composite bone tissue engineering scaffolds.

Bonemorphogenetic proteins； Recombinant proteins； Vancomycin； Delayed-action preparations；Microspheres； Stents； Bone diseases

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.09.001

A

1009-5519（2015）09-1281-02

2014-12-06）

贵州省遵义市科技局、遵义市第一人民医院联合基金项目（遵义科社合字[2013]1号）。

向柄彦（1978-），男，贵州遵义人，硕士研究生，副主任医师，主要从事骨关节创伤外科的研究；E-mail：xby1978@126.com。