番茄斑萎病毒对云南莴苣类蔬菜的侵染危害

郑宽瑜，吴 阔，董家红，方 琦，张仲凯

（云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南省农业生物技术重点实验室，农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室，昆明 650223）

莴苣（Lactucasativa），属于菊科莴苣属，是一种很常见的食用蔬菜。在云南种植的莴苣类蔬菜主要有生菜（LactucasativaL.var.ramosaHort.）、油麦菜（LactucasativaL.var.longifoliaLam.）、莴笋（LactucasativaL.var.angustanaIrish）。生菜和油麦菜经济价值高，生长快，每年种植8～11茬，给农户带来丰硕的经济效益。近年来由于病毒病的感染，严重地威胁着莴苣类蔬菜的生产。

番茄斑萎病毒属（Tospovirus）属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae），其代表种番茄斑萎病毒（Tomato spottedwiltvirus，TSWV）是目前已知寄主范围最广的植物病毒，能侵染从单子叶到双子叶的70个科925种以上的植物，包括番茄、烟草、辣椒、莴苣、马铃薯、花生、豌豆、菊花等重要经济作物和园艺作物，造成严重危害［1-2］。Tospovirus病毒粒体为球形，直径约80～100nm，具有双层脂膜组成的包膜，表面有镶嵌在包膜内的糖蛋白突起。该属病毒基因组为三分体，根据分子量的大小分别命名为L RNA，M RNA 和S RNA。L RNA为单个开放阅读框（ORF），编码病毒复制酶（RdRp）。M RNA 和S RNA 均为双义RNA，有2个ORFs，通过基因间区IGR 反向相连。M RNA 病毒链编码运动蛋白（NSm），互补链编码Gn／Gc前体蛋白，Gn／Gc蛋白与蓟马传播特性及病毒侵入寄主植物相关。S RNA 病毒链编码一个非结构蛋白（NSs），是基因沉默的抑制子，互补链编码核壳体蛋白即N 蛋白［3］。

云南迄今已报道的番茄斑萎病毒属病毒有TSWV、番茄环纹斑点病毒（Tomatozonatespotvirus，TZSV）、凤仙花坏死斑点病毒（Impatiensnecroticspot virus，INSV）、辣椒褪绿病毒（Capsicumchlorosisvirus，CaCV）、花生黄斑病毒（Groundnutyellowspotvirus，GYSV）、朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrumchlorotic ringspotvirus，HCRV）、马蹄莲褪绿斑点病毒（Calla lilychloroticspotvirus，CCSV）等6种病毒，能侵染番茄、辣椒、烟草、花卉等作物［4-9］。番茄斑萎病毒属病毒由蓟马传播，云南作为斑萎病发生区，传毒蓟马有西花蓟马［Frankliniellaoccidentalis（Pergande）］、棕榈蓟马（ThripspalmiKarny）、烟蓟马（ThripstabaciLindeman）、花蓟马［Frankliniellaintonsa（Trybom）］、番茄角蓟马［Ceratothripoidesclaratris（Shumsher）］［10-12］。

自2008年以来，云南种植的莴苣类蔬菜上发现疑似病毒病植株。田间调查发现，生长期较短的生菜和油麦菜（平均25d左右），发病率普遍为15%～20%，较严重的达到60%以上；生长期较长的莴笋，部分地块发病率达90%上，造成绝产绝收。为确定感染莴苣类蔬菜的病毒毒原，作者通过电子显微镜观察、回接试验、血清学检测、病毒基因分析等方法对样品进行了研究。

1 材料与方法

1.1 病毒样品及分离物

感病的56份蔬菜样品包括：30个生菜样品，分别采自晋宁、嵩明、石林、呈贡、泸西；18 个莴笋样品，分别采自泸西、嵩明、新平；8个油麦菜样品，采自嵩明。病毒嵩明莴笋分离物（SM-Lettuce）经枯斑寄主昆诺黎单斑分离后机械接种保存于本生烟和黄烟上。病毒也被回接到生菜和油麦菜上。

1.2 电子显微镜观察

取具有典型症状的感病组织0.1g，加入100 μL 2.5%的戊二醛，用刀片切碎直至植物汁液溢出。用Formvar膜覆盖的铜网吸附植物汁液，5 min 后用滤纸吸干铜网上的汁液，2%钼酸铵负染色3min，置于JEM100CX-Ⅱ型透射电镜下观察病毒粒体形态特征［13］。将病样组织切成1mm×1mm×3mm的组织块，浸入2.5%的戊二醛固定液中于4 ℃固定12h，0.2mol／L PBS（pH7.2）淋洗后，浸入1%的OsO4中固定2h，经乙醇梯度脱水后，Epon812环氧树脂包埋，AO 超薄切片机切片，5% 柠檬酸铅和1%醋酸双氧铀染色，置于JEM100CX-Ⅱ透射电子显微镜观察细胞病理切片［14］。

1.3 ELISA 检测

根据症状和病毒粒子形态特征，初步判定病毒分离物为番茄斑萎病毒属成员。进一步应用购自美国Agdia公司的番茄斑萎病毒（TSWV）以及自制的番茄环纹斑点病毒（TZSV），参照ELISA 试剂盒说明书，进行DAS-ELISA 检测。

1.4 RT-PCR扩增、克隆、测序、分析

根据DAS-ELISA 检测结果，选择嵩明莴笋SM-Lettuce，新平莴笋XP-Lettuce，泸西莴笋LXLettuce-1、LX-Lettuce-2，用购自Invitrogen的TRIzol提取总RNA。采用RT-PCR两步法对病毒N基因序列（引物序列 TSWV-FR：ATCGGATCCATGTCTAAGGTTAAGCTCAC；TSWV-NR：ATCCTCGAGTTAAGCAAGTTCTGCAAGTTTTGC）进行扩增。第一链cDNA合成反应体系为20μL，将总RNA 12 μL和1μL100nmol／L引物混合，70 ℃预变性10min后，迅速插入冰上5min，加入5×RT Buffer 4μL，10mmol／L dNTP 2μL，5 U／μL M-MLV Reverse Transcriptase（Promega）1μL，40U／μL RNase Inhibitor 1μL，42℃延伸90min。PCR 反应条件为：94℃预变性5min；94 ℃变性45s，55 ℃退火45s，72 ℃延伸1min，30个循环；最后72 ℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后，切取目标条带，用DNA 回收试剂盒（Sangon）回收，然后连接到pGEMT Easy载体（Promega）上，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α，涂布含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上，筛选阳性克隆。送华大基因公司测序。利用DNAMAN 5.0 进行序列处理、分析。进化树构建采用MEGA 5.05软件，以NJ（neighbor-joining）方法构建，进化树各分支的可信度用Bootstrap检测（1000次重复）。用于序列比较分析的TSWV 核衣壳蛋白基因序列（N基因序列）来自GenBank，序列注册号如下：韩国红椒分离物TSWV-KDRP（EF195230）、云南番茄分离物TSWV-KM（HQ402595）、韩国红椒分离物TSWV-Ghae（HQ260977）、新西兰万寿菊分离物TSWV-MAF02（KC494482）、云南番茄分离物TSWVYN（JF960235）、日本菊花分离物TSWV-Tospo-C（AB038341）、巴西番茄分离物TSWV-BR01（D00645）、新西兰凤仙花分离物TSWV-MAF09（KC494488）。

2 结果与分析

2.1 病害症状

疑似病毒病植株，通常心叶先显症，叶片由棕黄色逐渐变为黑色，随后老叶开始出现褪绿斑，后期形成坏死斑。若在苗期或移栽后即感染病毒，植株表现为生长缓慢，严重矮化，最后整个植株死亡（图1）。

图1 田间莴笋和生菜感染TSWV症状Fig.1 Symptoms of TSWV on Lactuca sativa L.var.angustanaIrish and Lactuca sativa L.var.ramosa Hort.in the field

2.2 电子显微镜观察结果

经钼酸铵负染色制样后电镜观察发现，病样粗汁液中含有较典型的球形病毒粒体，直径约80～100nm，未检测到其他形态的病毒粒体（图2a）。超薄切片电镜观察发现细胞中含有典型球形病毒粒体，病毒粒体具包膜，直径80～85nm，其形态与报道的Tospovirus病毒粒体相似［5］，有囊膜包裹的病毒粒体聚集体分布于细胞质内（图2b）。

图2 侵染莴笋的TSWV病毒粒子电镜照片Fig.2 Electron micrographs of viral particles from TSWV infected L.sativa L.var.angustanaIrish

2.3 序列分析

ELISA检测发现，56个样品中，有53个样品与TSWV抗体呈阳性反应，与TZSV 抗体呈阴性反应，其余3个红河泸西的莴笋样品与TZSV 抗体呈阳性反应。根据样品采集地点选择嵩明莴笋SM-Lettuce，新平莴笋XP-Lettuce，泸西莴笋LX-Lettuce-1、LXLettuce-2样品进行了RT-PCR扩增目的片段回收、克隆和测序。结果表明，扩增获得777个碱基的片段，该序列编码258个氨基酸。NCBI网站BLAST 分析发现莴苣类蔬菜与报道的TSWV 番茄分离物核苷酸同源性为99%～100%。表明感染莴苣类蔬菜的病毒主要是TSWV。将云南莴苣类蔬菜上的TSWV 与部分国内外的TSWV 的核壳体蛋白氨基酸序列绘制成系统发生进化树，进化树表明云南的4个莴笋分离物与云南番茄分离物TSWV-KM HQ402595、TSWVYN JF960235，以及韩国的2个辣椒分离物TSWVKDRP EF195230、TSWV-Ghae HQ260977 聚在同一分支（图3）。云南TSWV 莴苣分离物和TSWV 番茄分离物同源性最高，结果说明感染云南莴苣和番茄的TSWV属于同一分离物，没有发生变异。

图3 TSWV 不同分离物N 蛋白氨基酸序列的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of different TSWV isolates based on the deduced amino acid sequence of the N protein

3 讨论

莴苣类蔬菜是一类常用的食用蔬菜，病毒病害常常是其主要威胁，国外报道了10余种感染莴苣的病毒［15-16］。国内报道感染莴苣类蔬菜的病毒有莴苣花叶病毒、黄瓜花叶病毒、蒲公英黄花叶病毒［17］。莴苣花叶病毒属于马铃薯Y 病毒属病毒，病毒粒子为线状，大小为11nm×720nm；黄瓜花叶病毒、蒲公英黄花叶病毒粒子均呈球形，直径30nm。本试验电镜观察到的病毒粒子为80～100nm，血清学检测结果表明，病样汁液能与TSWV 抗体呈阳性反应，结果表明危害云南莴苣类蔬菜的病毒主要为TSWV，只有采自泸西的3个生菜样品被TZSV 感染。从莴笋上的病毒分离物接种回接莴笋、生菜、油麦菜，能产生与田间相同的症状。

调查发现病田传毒蓟马主要为西花蓟马［10］。西花蓟马自2000年首次在昆明国际花卉节缅甸参展的盆景上检测到，随后2003年在北京发现，近年已在全国许多地方发现［18-19］。因西花蓟马是TSWV 高效传播介体，由其传播的TSWV自2008年以来在云南、山东、北京等地广泛发生危害［4，20-21］。

对病田周围中间寄主调查发现，田间杂草鬼针草带毒率较高，其次为苦苣菜，初侵染为苗期蓟马从鬼针草等带病杂草或作物上传入，移栽后，除从鬼针草等带病杂草或作物上传入，如果防控措施不到位，二次侵染也是重要的传播方式。

因目前缺少抗病品种，当前对莴苣类蔬菜上发生的番茄斑萎病毒病害的管理应该采取“综合防控，预防为主”的措施。预先除草杀虫，苗床及田块周边避免种植易感作物，挂放西花蓟马有偏好的蓝色粘板，根据蓟马种群动态及时喷施杀虫剂。

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