甘肃省苹果蠹蛾不同地理种群遗传多样性分析

张大为，罗进仓，周昭旭，魏玉红，刘月英

（甘肃省农业科学院植物保护研究所，兰州 730070）

苹果蠹蛾［Cydiapomonella（L.）］属鳞翅目，卷叶蛾科，小卷蛾亚科，以幼虫蛀食苹果、梨、桃、李、沙果等多种果树的果实，造成大量落果，是水果生产上的毁灭性检疫害虫。该虫寄主范围广、繁殖能力强、危害程度高、适应能力强，是世界温带落叶果树的重要害虫［1］。苹果蠹蛾最早起源于欧亚大陆中南部［2］，1957年在我国新疆首次被记录为害［3］，2007 年 和2009年分别被列入中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录和全国农业植物检疫性有害生物名单［4-5］。苹果蠹蛾1987年传入甘肃省酒泉地区［6］，后逐年向东扩散，现已越过祁连山、乌鞘岭等天然屏障，继续向东传播，在甘肃兰州以西均有分布报道［7-8］。目前，苹果蠹蛾有进一步东侵的趋势，在黑龙江、辽宁也有其发生为害报道，已对我国黄土高原和环渤海湾两大苹果优势产区形成东西夹攻之势，严重威胁我国的果品生产。

国内学者对苹果蠹蛾的研究，主要集中在生物学［9-10］、生态学［8，11-14］、综合防治［15-19］及适生性［7，20-21］等方面，有关苹果蠹蛾种群遗传多样性的研究还比较少。冯纪年等分析了10个苹果蠹蛾地理种群，认为已经存在一定程度的种群分化，在我国由西向东传播［22］；门秋雷等筛选了6个在中国苹果蠹蛾种群中可以稳定扩增的微卫星位点［23］；李玉婷等认为河西地区苹果蠹蛾种群遗传多样性较低，已经存在一定程度遗传分化［24］。在国外，有学者认为，由于苹果蠹蛾自身活动能力限制，不同种群间存在遗传多样性的原因是种群之间缺乏基因交流［25］。一些研究发现，同一个国家不同地理区域内的苹果蠹蛾种群之间并不存在显著的遗传分化［26-28］。也有些研究发现，即使是在相隔距离小于10km的两个苹果蠹蛾种群之间也存在显著的遗传分化［29］。因此，为探明甘肃省境内苹果蠹蛾不同地理种群间的遗传分化及扩散路径，有必要对其分子遗传变异情况进行研究。本文利用9对引物对甘肃省9个不同地理种群的遗传多样性进行了研究，以明确甘肃苹果蠹蛾种群间的遗传变异、种群分化及传播扩散路径，为制定苹果蠹蛾的防控阻截策略提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

试验用样本均采集于2011年4-8月，在甘肃省内苹果蠹蛾危害区选取有代表性的果园，于果树老翘皮下、枝干缝隙处及蛀果内采集苹果蠹蛾越冬代老熟幼虫及第1代4～5龄幼虫。采集完毕后，记录采样地点经纬度等信息（表1）。采集样本在饥饿24h后，单头浸泡于含无水乙醇的指形管内带回实验室，若液体变色则更换无水乙醇，所有样本保存于-20℃冰箱备用。

表1 试验样本采集信息Table 1 Sample collection information

1.2 引物筛选

各微卫星位点扩增所用的引物序列参考Franck等［2］和Zhou 等［30］发表的微卫星序列（表2），委托上海捷瑞生物工程技术服务有限公司合成。经过筛选，选取了9对扩增条带清晰、重复性较好的引物用于对苹果蠹蛾DNA 样品扩增。

1.3 基因组DNA 的提取与检测

采用Tiangen公司DP304-2动物组织基因组DNA提取试剂盒提取单头苹果蠹蛾样本总DNA，经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后，用尤尼柯（上海）仪器有限公司生产的Unico 4802H 型紫外可见分光光度计检测，估算DNA的浓度与纯度，并稀释至45ng／μL，4℃保存备用。

1.4 PCR扩增及产物检测

PCR扩增反应在PTC-100PCR 仪（MJ Research Company）上进行，反应体积为25μL，其中DNA 模板1μL（45ng／μL），10×PCR buffer 2.5μL，上、下游引物各0.5μL，TaqDNA聚合酶1μL，ddH2O 17.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；95℃变性30s，55～60℃（根据各引物退火温度有所不同）退火30s；72 ℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，产物于4℃保存备用。扩增产物通过6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）进行检测，采用JY 600＋电泳仪和DYC-30型垂直电泳槽（北京六一仪器厂），电压10V／cm，约2h，在指示剂到达胶板最底端时，结束电泳，采取硝酸银染色法显色，然后根据标准分子量marker（本研究采用PBR322DNA／Mspl，北京天根生物技术有限公司生产）标示扩增条带大小，并根据结果读带，采用数码相机拍照，保存胶板图像。

表2 试验所用9对微卫星引物Table 2 Microsatellite primers used in this study

1.5 数据统计和分析

假设群体处于Hardy-Weinberg 平衡，排除模糊不清和无法准确识别的条带，对SSR 扩增的多态性条带，按照电泳图谱中同一位置上DNA 带进行量化统计，有条带的量化为1，无条带的量化为0，生成0，1二维矩阵。利用POPGENE 1.32软件对全部位点及全部种群和个体进行遗传参数分析，结合NTSYSpc 2.1软件进行遗传多样性评价［31］。

2 结果与分析

2.1 不同苹果蠹蛾种群的遗传多样性分析

遗传多样性分析（表3）表明，苹果蠹蛾9个地理种群的观测等位基因Na为1.045 5～1.272 7，平均为1.131 3，有效等位基因Ne为1.032 1～1.192 8，平均为1.092 8，Nei氏基因多样性指数为0.018 8～0.113 0，平均为0.054 4，Shannon指数为0.027 5～0.164 9，平均为0.106 9，多态位点百分率为4.55%～27.27%，平均为13.13%。可以看出9个种群中，兰州七里河和临泽种群遗传多样性较高，Shannon指数分别为0.164 9和0.137 4。

表3 甘肃不同地理种群苹果蠹蛾的遗传变异参数Table 3 Genetic variation parameters of different geographical populations of the codling moth in Gansu

2.2 遗传相似度、遗传距离以及地理距离相关性

利用POPGENE 1.32软件对9个种群的遗传相似度和遗传距离（表4）计算发现，相似度在0.325 8～0.817 0之间，其中高台种群和临泽种群遗传相似度最低，相互遗传相似度最高的是甘州种群和金塔种群。

表4 甘肃不同地理种群苹果蠹蛾遗传距离（左下）和遗传相似度（右上）Table 4 Genetic distance（L＋B）and genetic similarity（R＋U）between pairwise geographical populations of codling moth in Gansu Province

利用Google地理距离计算器Google maps distance calculator，获得了9 个采样点的直线地理距离，通过NTSYSpc软件中的MXCOMP 程序分析遗传距离与地理距离的相关性，得到了地理距离与遗传距离的相关关系图（图1），图中可以看出，数据分布散乱，没有明显的规律性，Mantel检测结果，相关系数r＝-0.078 9，P＝0.653 0（P＞0.05），表明相关程度较低。由此可见，甘肃9个苹果蠹蛾地理种群间的遗传距离与地理距离间无显著相关性。

图1 苹果蠹蛾9个地理种群之间遗传距离和地理距离相关性Fig.1 Correlation between genetic distance and geographic distance among 9populations of the codling moth

2.3 聚类分析

2.3.1 UPGMA 遗传图谱

通过POPGENE 1.32软件得到种群间的遗传相似度，利用NTSYSpc 2.1软件得到甘肃9个苹果蠹蛾种群的UPGMA 聚类图（图2）。可以看到，甘州种群与金塔种群聚为一支，两者与肃州种群合为一个分支；临泽种群与总寨种群聚为一个分支；七里河种群与敦煌种群聚为一支；高台种群与民勤种群聚为一支。

图2 苹果蠹蛾种群Nei氏遗传相似度UPGMA聚类图Fig.2 UPGMA dendrogram of 9geographical populations of the codling moth based on Nei’s genetic identity

2.3.2 各分支遗传多样性统计

通过表5数据可以看出，在甘肃苹果蠹蛾种群的4个分支中，分支Ⅰ即甘州、金塔、肃州种群分支的遗传多样性水平明显高于其他种群分支，遗传多样性水平由高到低依次是分支Ⅰ＞分支Ⅳ＞分支Ⅱ＞分支Ⅲ。

2.3.3 各分支间F统计及基因流

种群间分化系数Fst越大表明种群分化程度越高［32］，表6 可以看出，甘肃省苹果蠹蛾4 个种群分支的遗传分化系数平均为0.695 6，七里河和敦煌种群分支的遗传分化系数最高，为0.857 9，最低为临泽与总寨种群分支的0.531 4；各分支的基因流在0.082 8～0.441 0之间，平均为0.247 2。

3 讨论

遗传多样性可以反映一个物种适应环境的能力，多态信息含量、Shannon指数及Nei氏基因多样性指数均是衡量种群遗传多样性的指标，当多态信息含量＞0.5时［33］，为高度多态位点，本研究中4大分支的多态信息含量为95.45%，表明本研究所用的微卫星标记能够有效地反映苹果蠹蛾群体的遗传多样性变异情况。Nei氏指数和Shannon 指数表明，甘肃省苹果蠹蛾种群4大分支的遗传多样性较低，且敦煌与七里河两个种群分支遗传多样性最低，推测由于随着入侵过程、遗传漂变及瓶颈效应的共同影响，造成遗传多样性的下降，与李玉婷等［24］研究结果一致。本研究中种群间的平均Fst值为0.695 6，表明种群的遗传变异主要发生在种群间，种群内的遗传变异只占总变异的很少部分，与Chen和Dorn［29］、门秋雷等［23］的研究结果一致。Fis、Fit的平均值分别为0.054 9和0.181 4，表明研究的4大种群在各种群内部存在较严重的近交，基因流Nm为0.247 2（＜1）说明4 个种群之间基因交流较少，与Timm 等［25］的研究结果一致，可能与苹果蠹蛾侵入甘肃时间较短，且自身飞行扩散能力较弱有关。

表5 甘肃苹果蠹蛾各分支间遗传多样性统计Table 5 Genetic diversity statistics of different codling moth clades in Gansu

表6 甘肃苹果蠹蛾4个分支的F 统计及基因流Table 6 F-statistics and gene flow of four population clades of the codling moth in Gansu

本研究发现甘肃省苹果蠹蛾种群分布呈现4大分支的格局，金塔、肃州、甘州种群聚为一支；兰州七里河种群和敦煌种群聚为一支；临泽、总寨种群聚为一支，此3个分支应为同一个入侵来源，其中敦煌与七里河种群遗传多样性最低，表明敦煌种群为最初入侵来源，七里河种群自敦煌传播而来；高台、民勤种群与其他3个种群遗传距离相对较远，独立为一支，怀疑为甘肃省苹果蠹蛾的另一个入侵来源，各分支的遗传关系有待于今后采集其他省份及国外种群样本进行遗传多样性分析验证。临泽与甘州、肃州与总寨种群采集点之间的直线距离都只有十几公里，然而几个种群均聚为不同的分支，遗传多样性显示出较大的差异，这与Chen和Dorn［29］的研究结果一致。Mantel检测结果表明甘肃9 个苹果蠹蛾地理种群间的遗传距离与地理距离间无显著相关性，与Men等［34］和李玉婷等［35］的研究结果一致。本研究采样点均分布在国道省道附近，敦煌与七里河种群地理距离最远，七里河种群发现报道最晚，两者遗传关系最近，推测两地是全省重要的旅游中心及交通枢纽，也进一步印证了苹果蠹蛾更多是通过借助外力进行点对点传播扩散的可能性。

综上，可以判定9个苹果蠹蛾种群在甘肃省内已经形成一定程度的遗传分化，入侵扩散以人为传播为主，总体趋势并非自西向东，而是随外部介质的点对点的随机传播扩散。目前，甘肃省河西地区果品产业规模相对较小，东部果区作为黄土高原苹果优势产区之一，在当地已经形成区域特色支柱产业，在兰州以东尚未有苹果蠹蛾发生的相关报道，因此，苹果蠹蛾的防控阻截显得尤为重要，应该遵循以下策略：在苹果蠹蛾危害区，进一步强化果农对苹果蠹蛾危害严重性的认识与宣贯，做到发现疫情消灭疫情；全省范围内开展苹果蠹蛾在其他寄主上发生的监测与测报；进一步强化疫区果品运输的检验检疫，严防苹果蠹蛾进入非疫区。

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