miR-146a通过抑制ROCK 1基因的表达促进去势抵抗性前列腺癌细胞的凋亡

蒋亮，刘春辉，许斌，陈明

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学 附属中大医院，江苏 南京 210009)

·论 著·

miR-146a通过抑制ROCK 1基因的表达促进去势抵抗性前列腺癌细胞的凋亡

蒋亮1，刘春辉1，许斌2，陈明2

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学 附属中大医院，江苏 南京 210009)

目的:探讨miRNA-146a对激素非依赖前列腺癌细胞DU145、PC3凋亡的影响极其作用机制。方法:通过Hoechst染色方法观察高表达miRNA-146a对前列腺癌细胞凋亡的影响。通过免疫印迹法(Western blot)观察高表达miRNA-146a对cleave-caspase 3表达的影响。构建ROCK1 3′UTR报告基因质粒，合成miRNA-146a minics，分别共转染DU145、PC3两种前列腺癌细胞，采用荧光素酶报告基因(Luciferase)实验检测miR-146a是否与ROCK1相结合，采用免疫印迹法(Western blot)检测miR-146a干扰后ROCK1蛋白量的表达。结果：Hoechst染色显示，转染miRNA 146a后可以促进DU145和PC3的凋亡。高表达miR-146a后cleave-caspase 3 表达增加。Luciferase及Western blot显示，miR-146a通过与靶基因ROCK1 3′UTR的结合抑制ROCK1的表达。结论：ROCK1是miR-146a的靶基因，miR-146a通过抑制ROCK1基因的表达促进前列腺细胞的凋亡。

前列腺癌；Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1；细胞凋亡

前列腺癌(prostate cancer， PCa)是西方国家男性常见恶性肿瘤之一，在美国，其发病率在所有男性恶性肿瘤中居第1位[1]。年龄是PCa最主要的危险因素[2]，随着我国进入老龄化社会，我国PCa的发病率正逐年上升。研究PCa的发生发展的分子机制有着十分重要的意义。既往研究表明，miRNA在PCa的发生发展中有着十分重要的作用。miRNA是一类长度约为22 nt的内源性非蛋白质编码小分子RNA，主要通过在转录后水平调控基因表达[3]。在人类基因组中，miRNAs调控大约1/3的蛋白编码基因，控制细胞的增殖、分化与凋亡活动。一些研究表明，miR-146a在激素非依赖PCa中呈低表达。本实验拟通过相关实验方法检测miR-146a对PCa细胞凋亡的影响及miR-146a干扰后ROCK1蛋白量的表达。进一步明确miR-146a在去势抵抗性PCa凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞系 PCa细胞DU145、PC3均购自上海生命科学研究院细胞库。

1.1.2主要试剂 胎牛血清购自HyClone公司， F12、DMEM培养基购自Gibco公司。Lipofectamin 2000试剂购自Invitrogen公司，psiCHECK-2质粒由南京医科大学惠赠，Top10感受态细胞购自北京康为世纪生物科技有限公司，NotⅠ、XhoⅠ内切酶和T4连接酶购自TaKaRa公司，Hoechst、Luciferase、BCA、ECL发光试剂盒购自碧云天公司，高纯度质粒中量小提试剂盒购自天根生化科技有限公司。鼠抗人ROCK1 抗体购自Abcam公司，兔抗人cleave-caspase 3抗体购自Cell Signaling Technology公司，兔抗人GAPDH抗体购自SantaCruz公司，辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 以含10%胎牛血清的完全培养基在细胞培养箱中培养，以0.25%的胰酶消化细胞，每周传代2～3次。

1.2.2合成miR-146a干扰RNA miR-146a由上海吉玛公司合成，序列为 5′-UGAGAACUGA A UUCCAU GGGUU-3′;N/C序列为5′-UUCUCCGAACGUGUC AC GU TT-3′。

1.2.3Hoechst染色观察细胞凋亡 采用Hoechst染色试剂盒，将盖玻片置于6孔板内，选择对数生长期DU145/PC3 细胞，以无抗生素DMED/ F12培养基接种于6孔培养板中，用于转染，将15 μl hsa-miR-146a/ NC mimics加入750 μl Opti-MEM 培养基中，吹匀；将15 μl Lipofectamine 2000加入750 μl Opti-MEM 培养基中，吹匀；5 min后，将两管液体混匀，室温放置30 min；将上述混合物加入6孔板中，摇匀。转染72 h后，吸除旧培养基，实验方法参见文献[4]。

1.2.4构建ROCK1 3′UTR报告基因质粒 根据ROCK1基因在GenBank中的序列，运用引物设计专用软件Primer5设计引物。上游引物: 5′-ACGCTCGAGGGCTTTGCAGTA ATGTGT ATCAG；下游引物: 5′-CTA GCGGCCGC GAGACGTTAT CTTTATT ATAC；酶切位点为NotⅠ、XhoⅠ。PCR扩增体系:DNA 1 μl，ddH2O 22 μl，PCR MIX 25 μl，上下游引物各1 μl，共计50 μl。扩增条件:95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，共35个循环。琼脂糖凝胶电泳后切胶，纯化。酶切: ddH2O 3.2 μl，DNA/ psiCHECK-2载体5 μl，Buffer-Tango 1 μl，NotⅠ0.4 μl，XhoⅠ 0.4 μl，共计10 μl。37 ℃ 4～5 h。连接:DNA 5 μl，psiCHECK-2载体3 μl enovo，混匀后放置45 ℃ 5 min，冰浴3 min，加入T4连接酶1 μl和T4专用Buffer 1 μl，22 ℃过夜。转化大肠杆菌，挑克隆，摇菌过夜，菌液测序，提质粒备用。

1.2.5Luciferase实验 选择对数生长期DU145/PC3 细胞，转染前1 d，以无抗生素DMED/F12培养基接种于24孔培养板中，用于共转染，将750 ng Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶1(ROCK1)质粒、6 μl hsa-miR-146a/ NC mimics加入150 μl Opti-MEM 培养基中，吹匀；将6 μl Lipofectamine 2000加入另一 150 μl Opti-MEM 培养基，吹匀；5 min后，将两管液体混匀，室温放置30 min；将上述混合物加入24孔板中，摇匀。转染48 h后，按照Luciferase、ECL发光试剂盒说明书进行，每组重复3次。

1.2.6Western blot检测转染后ROCK1、cleave-caspase 3蛋白表达 转染方法见1.2.3。转染72 h后裂解细胞，提取蛋白。采用BCA试剂盒检测总蛋白浓度。SDS-PAGE电泳完成后，电转移法将蛋白质转移到PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜， 加入ROCK1/cleave-caspase 3抗体(1∶500 )，4 ℃摇床过夜，HRP标记的二抗，室温孵育1 h，用ECL试剂于暗室中显影并曝光。以GAPDH作为内参。

1.3 统计学处理

每组实验重复3次，数据采用SPSS 16.0软件处理。组间比较采用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Hoechst染色检测miR-146a对DU145/PC3细胞凋亡的影响

Hoechst染色结果(图1)显示，正常细胞核Hoechst染色的形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒；而凋亡细胞的细胞核由于浓集而呈亮蓝色，或核呈分叶、碎片状，边集。说明miR-146a能够明显促进DU145/PC3细胞的凋亡。

图1 Hoechst染色检测miR-146a对DU145/PC3细胞凋亡的影响

2.2 Luciferase检测miR-146a与其靶基因ROCK 1的结合

通过diana软件预测发现miR-146a能够与ROCK1的3′UTR直接结合(图2A)。报告基因检测发现，转染组与对照组相比荧光强度受到明显抑制(P<0.05，图2B)。

A.diana预测结合位点；B.统计结果

图2 Luciferase显示miR-146a与ROCK直接结合

2.3 Western blot检测cleave-caspase 3 和ROCK1蛋白量的表达

转染miR-146a后cleave-caspase 3 表达增加， ROCK1的表达降低(图3)。

3 讨 论

目前我国PCa的发病率呈上升趋势，而且几乎所有患者的病变都将逐渐发展为去势抵抗性前列腺癌(Castration-refractory prostate cancer， CRPC)，目前对CRPC尚缺乏有效的治疗药物。因此，探讨CRPC凋亡过程的分子机制，具有广泛的应用空间和前景。细胞生长周期中存在有增殖、分化和凋亡3个特性，其中细胞凋亡是机体细胞在生理或病理条件下发生的一种自发的程序化死亡过程，它的发生受体内外多种因素的影响，涉及一系列相关基因的改变[5]。近年来miRNA成为研究热点，到目前为止，有超过50个miRNAs被发现在PCa中异常表达[6-7]，通过实验证实，miR-221/222、miR-21和miR-125b等有促癌基因功能，miR-101、miR-146a、miR-330，miR-34簇等有抑癌基因功能[8]。因此，与PCa凋亡有关的miRNA的作用机制尚需进一步明确。

图3 Western blot检测ROCK1、cleave-caspase 3蛋白的表达

研究发现，随着PCa的进展，miR-146a的表达下降[9]，扮演抑癌基因的作用，可能是通过影响前列腺癌细胞的凋亡作用实现的。因此我们通过Hoechst染色方法检测miR-146a对前列腺癌细胞凋亡的影响，结果显示miR-146a能够促进DU145/PC3细胞的凋亡。研究表明miRNAs是非编码RNA，主要通过在转录后水平调控基因表达。miRNA与靶mRNA的3′UTR端通过碱基互补配对的方式结合，通过诱导mRNA的降解与抑制翻译来调控蛋白质的表达[10]。因此miR-146a促进前列腺癌凋亡有可能是通过抑制其靶基因的表达来实现的。

ROCK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族[11]，与细胞凋亡有关。ROCK 由ROCK 1和ROCK 2两种异构体构成，它们均参与细胞凋亡过程[12]。ROCK 接受Rho传递的活化信号，发生多个氨基酸位点的磷酸化而激活，并介导下游一系列磷酸化/脱磷酸化反应[13]，最终引起细胞状态的改变。但是关于ROCK 1的异常表达是否会引起前列腺癌细胞凋亡尚未见报道。在本实验中，我们通过Luciferase证实了ROCK 1是miR-146a的靶基因，然后通过Western blot验证了miR-146a促进cleave-caspase 3的表达同时抑制了ROCK 1的表达。因此，下调ROCK 1的表达会引起前列腺癌细胞凋亡。

综上所述，miR-146a能够通过抑制ROCK 1基因表达而促进CRPC细胞的凋亡，可以为今后PCa的治疗提供新思路，但是其具体的作用途径尚不明了，还需要进一步研究。

[1] SIEGEL R,MA J,ZOU Z,et al.Cancer statistics,2014[J].CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.

[2] van der WALDE A,HURRIA A.Aging and osteoporosis in breast and prostate cancer[J].CA Cancer J Clin,2011,61(3):139-156.

[3] MISHRA S,LIN C L,HUANG T H,et al.MicroRNA-21 inhibits p57Kip2 expression in prostate cancer[J].Mol Cancer,2014,13(1):212.

[4] 曹倪豪,陈明.BTG1在肾透明细胞癌组织中的表达及对786-O细胞株增殖和凋亡的影响[J].东南大学学报:医学版，2011,30(4):583-587.

[5] NICHOLSON D W,THORNBERRY N A.Life and death decisions[J].Science,2003,299(5604):214-215.

[6] SUN R,FU X,LI Y,et al.Global gene expression analysis reveals reduced abundance of putative microRNA targets in human prostate tumours[J].BMC Genomics,2009,10(1):93.

[7] SANTARPIA L,NICOLOSO M,CALIN G A.MicroRNAs:a complex regulatory network drives the acquisition of malignant cell phenotype[J].Endocr Relat Cancer,2010,17(1):F51-F75.

[8] PANG Y,YOUNG C Y F,YUAN H.MicroRNAs and prostate cancer[J].Acta Biochim Biophys Sin,2010,42(6):363-369.

[9] XU B,WANG N,WANG X,et al.MiR-146a suppresses tumor growth and progression by targeting EGFR pathway and in ap-ERK-dependent manner in castration-resistant prostate cancer[J].Prostate,2012,72(11):1171-1178.

[10] BARTEL D P.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[11] TU D,LI Y,SONG H K,et al.Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK Ⅰ[J].PLoS One,2011,6(3):e18080.

[12] ARK M,ÖZDEMIR A,POLAT B.Ouabain-induced apoptosis and Rho kinase:a novel caspase-2 cleavage site and fragment of Rock-2[J].Apoptosis,2010,15(12):1494-1506.

[13] ZHANG X,LI C,GAO H,et al.Rho kinase inhibitors stimulate the migration of human cultured osteoblastic cells by regulating actomyosin activity[J].Cell Mol Biol Lett,2011,16(2):279-295.

miR-146a promotes the apoptosis of castration-resistant prostate cancer by inhibiting the expression of ROCK 1

JIANG Liang1，LIU Chun-hui1，XU Bin2，CHEN Ming2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To explore the affect and mechnism of miRNA-146a promoting the apoptosis of castration-resistant prostate cancer cells (DU145/PC3). Methods: Hoechst assay were performed to study the effect of high expression of miRNA-146a on apoptosis of prostate cancer cells. Western blot method were used to observe the high expression of miRNA-146a on expression of cleave-caspase 3. The ROCK1 3′UTR report gene plasmid was constructed and miRNA-146a minics was designed， followed by transferection into DU145 and PC3 cells respectively. The luciferase report gene detected the combination of miRNA-146a and its potential target genes ROCK1， Western blot was used to detect the amount of protein expression of ROCK1. Results: miRNA-146a promoted two kinds of prostate cancer cells DU145 and PC3 apoptosis. Cleave-caspase 3 expression was increased with high expression of miRNA-146a. The expression of ROCK1 was inhibited by combination of miRNA-146a with target gene ROCK1 3′UTR. Conclusion: miRNA-146a promotes the apoptosis of prostate cancer cells by inhibiting the expression of ROCK1.

prostate cancer; Rho-associated coiled-coil protein kinase 1; apoptosis

2014-12-01

2015-02-15

国家自然基金(81370849、81300472、81202034)、临床医学科技专项——新型临床诊疗技术攻关基金(BL2013032)、教育部博士点基金(20120092120071)、江苏省自然科学基金(BK2012336)、南京市科技发展项目基金(201201053)、东南大学新教师基本科研项目基金(3290002402)资助项目

蒋亮(1989-)，男，山东枣庄人，在读硕士研究生。E-mail:jiangliang135@163.com

陈明 E-mail:mingchenseu@126.com

蒋亮，刘春辉，许斌，等.miR-146a通过抑制ROCK 1基因的表达促进去势抵抗性前列腺癌细胞的凋亡[J].东南大学学报:医学版，2015，34(3)：357-360.

R737.25

A

1671-6264(2015)03-0357-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.005