白藜芦醇对肥胖者骨性关节炎软骨细胞的作用及对TLR4、NF-κBmRNA表达的影响

焦永亮，刘慧敏，2，顾海伦，李克雨，李星瑶，于晓璐，刘莉

(1.中国医科大学公共卫生学院 营养与食品卫生教研室，辽宁 沈阳 110122；2.内蒙古自治区 地方病防治中心，内蒙古 呼和浩特 010030；3.中国医科大学附属盛京医院 骨科，辽宁 沈阳 110004)

·论 著·

白藜芦醇对肥胖者骨性关节炎软骨细胞的作用及对TLR4、NF-κBmRNA表达的影响

焦永亮1，刘慧敏1，2，顾海伦3，李克雨1，李星瑶1，于晓璐1，刘莉1

(1.中国医科大学公共卫生学院 营养与食品卫生教研室，辽宁 沈阳 110122；2.内蒙古自治区 地方病防治中心，内蒙古 呼和浩特 010030；3.中国医科大学附属盛京医院 骨科，辽宁 沈阳 110004)

目的:探讨白藜芦醇是否可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路发挥抗骨性关节炎的作用。方法:采用两步酶消化法分离培养肥胖者骨性关节炎软骨细胞。免疫细胞化学染色及甲苯胺蓝染色对细胞进行表型鉴定。应用MTT法测定白藜芦醇对软骨细胞增殖活力的影响。ELISA法检测细胞培养基上清TNF-α的水平。RT-PCR法检测TLR4、NF-κBmRNA表达水平。结果:软骨细胞Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色及蛋白多糖甲苯胺蓝染色呈阳性。白藜芦醇浓度在6.25～100 μmol·L-1时对细胞增殖均无抑制作用，其中低浓度的白藜芦醇(6.25～12.5 μmol·L-1)能促进细胞增殖(P<0.05)。IL-1β(10 ng·ml-1)能抑制细胞增殖(P<0.05)。白藜芦醇浓度在6.25～12.5 μmol·L-1时，对IL-1β诱导的细胞活力降低有显著抑制作用。相比对照组，IL-1β诱导组的培养基上清中TNF-α水平及软骨细胞TLR4、NF-κBmRNA表达均明显增加(P<0.01)，而加入白藜芦醇(6.25～12.5μmol·L-1)处理后，TNF-α水平及TLR4、NF-κBmRNA表达均显著降低(P<0.01)。结论:白藜芦醇可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路发挥抗骨性关节炎效应。

软骨细胞；白藜芦醇；Toll样受体4；骨性关节炎；肥胖

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种退行性关节病变，临床主要表现为进行性关节疼痛、僵硬、功能障碍。目前肥胖在全球范围内的急剧增加已经成为OA增加的重要原因之一[1]。肥胖时游离脂肪酸增多，激活巨噬细胞和脂肪细胞表面的Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)[2]，从而诱发细胞内炎性信号通路，促使炎症因子白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及单核细胞趋化蛋白等的释放，造成局部和全身慢性炎症[3-4]。研究显示，白藜芦醇(resveratrol，RES)可以通过抑制凋亡、抗炎和抗氧化作用发挥抗OA效应。其中，RES发挥抗炎作用的中心环节是通过抑制核因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)的活化，进而下调促炎症因子的表达而实现的[3-6]。因此，本研究选择肥胖OA患者的膝、髋关节软骨细胞进行体外培养，首先观察RES对退变的肥胖者炎症软骨细胞的作用；然后通过检测TLR4、NF-κBmRNA的表达，探讨其是否通过抑制TLR4/NF-κB信号通路发挥抗OA的作用。

1 材料与方法

1.1 软骨组织来源

经中国医科大学附属盛京医院医学伦理委员会批准，患者知情同意后获取20例因OA而行膝、髋关节置换的患者关节软骨组织(男10例，女10例)。患者年龄48～70岁，BMI指数大于28。

1.2 主要仪器和试剂

MultiskanMK3酶标仪(美国Thermo公司)，7500 Real-Time PCR仪(美国ABI公司)。IL-1β(美国PeproTech)，RES、DMSO和MTT(美国Sigma)，DMEM-F12(美国Hyclone)，Ⅱ型胶原一抗(武汉博士德)，SP试剂盒(北京中杉金桥)，Trizol 和RT-PCR试剂盒(大连宝生物)，ELISA试剂盒(武汉博士德)。

1.3 方法

1.3.1软骨细胞的分离及培养 提取关节软骨组织中软骨细胞进行原代细胞培养，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，72 h更换培养基。待软骨细胞贴壁达到80%～90%后传代。传代细胞用含10%FBS的DMEM-F12培养基培养，传至第3代使用。

1.3.2软骨细胞表型鉴定 Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色方法:软骨细胞爬片、固定后，按SP试剂盒说明书操作。蛋白多糖甲苯胺蓝染色方法:软骨细胞爬片、固定，1%甲苯胺蓝染色30 min，无水乙醇脱水，镜下观察。

1.3.3MTT法检测RES对细胞活性的影响 第2代关节软骨细胞消化后，接种于96孔培养板中，每孔100 μl(103～104个细胞)。细胞分组:对照组、溶剂对照组(0.1%DMSO)、RES处理组(浓度分别为6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)、IL-1β组(IL-1β+0.1%DMSO)、IL-1β+RES处理组(RES浓度分别为6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)，IL-1β的终浓度是10 ng·ml-1。细胞处理24 h后，按MTT试剂盒说明书操作。

1.3.4细胞处理 第2代关节软骨细胞消化后接种于6孔板中，待细胞融合至80%～90%后，换用0.5%FBS的培养液，细胞加10 ng·ml-1IL-1β预先孵育1 h后再加RES处理，分组如下:对照组(0.1%DMSO)、IL-1β组(IL-1β+0.1%DMSO)、IL-1β+RES处理组(RES浓度6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)，每组设3个复孔，24 h后收集细胞及培养基上清。

1.3.5培养基上清TNF-α水平的测定 采用ELISA法，按试剂盒说明书操作。

1.3.6RT-PCR检测TLR4、NF-κBmRNA表达 采用RT-PCR检测，按试剂盒说明书操作。数据分析:β-actin作为内参基因，数据分析采用2-ΔΔCt分析法。β-actin引物序列(101 bp):上游5′-CACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游5′-CTCAGTGAGGATCTTCATGAGGTAGT-3′；TLR4引物序列(148 bp):上游5′-AGGACTGGGTAAGGAATGAGC-3′，下游5′-ATCACCTTTCGGCTTTTATGG-3′；NF-κB引物序列(218 bp):上游5′-AGGAGAGGATGAAGGAGTTGTG-3′，下游5′-CCAGAGTAGCCCAGTTTTTGTC-3′。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 软骨细胞鉴定

如图1所示，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色，软骨细胞胞浆均呈棕黄色；蛋白多糖甲苯胺蓝染色可见细胞呈蓝紫色。

A.免疫细胞化学染色×200；B.甲苯胺蓝染色×200

图1 第3代软骨细胞

2.2 不同浓度RES对肥胖者软骨细胞活性的影响见图2。

与溶剂对照组比较，aP<0.05；与IL-1β组比较，bP<0.05

图2 不同浓度RES对肥胖者OA软骨细胞活性的影响

由图2可见，溶剂对照组与对照组相比，细胞活力无明显差异(P>0.05)。RES浓度范围在6.25～12.5 μmol·L-1时可以促进细胞增殖(P<0.05)；RES浓度范围在25～100 μmol·L-1时，对细胞增殖无明显影响(P>0.05)。当用IL-1β预先孵育软骨细胞1 h后，细胞活力明显降低(P<0.05)；而加入RES后，在6.25～12.5 μmol·L-1浓度时，可以显著抑制IL-1β诱导的细胞活力降低(P<0.05)。

2.3 不同浓度RES对IL-1β诱导的肥胖者OA软骨细胞分泌TNF-α水平的影响

见图3。

由图3可见，加入IL-1β诱导后，培养基上清中TNF-α水平明显增加(P<0.01)；相比IL-1β组，不同浓度RES(6.25～100 μmol·L-1)处理后，TNF-α水平均显著下降(P<0.01)。

2.4 不同浓度RES对IL-1β诱导的肥胖者OA软骨细胞TLR4mRNA表达的影响见图4。

由图4可知，加入IL-1β诱导后，软骨细胞TLR4mRNA表达明显增加(P<0.01)；相比IL-1β组，不同浓度RES(6.25～100 μmol·L-1)处理后，TLR4mRNA均显著下降(P<0.01)。

与对照组比较，aP<0.01；与IL-1β组比较，bP<0.01

图3 不同浓度RES对IL-1β诱导的肥胖者OA软骨细胞分泌TNF-α水平的影响

与对照组比较，aP<0.01;与IL-1β组比较，bP<0.01

图4 不同浓度RES对IL-1β诱导的肥胖者OA软骨细胞TLR4mRNA表达的影响

2.5 不同浓度RES对IL-1β诱导的肥胖者OA软骨细胞NF-κBmRNA表达的影响

见图5。

与对照组比较，aP<0.01；与IL-1β组比较，bP<0.01

图5 不同浓度RES对IL-1β诱导的肥胖者OA软骨细胞NF-κBmRNA表达的影响。

由图5可知，加入IL-1β诱导后NF-κBmRNA表达增加了80%(P<0.01)，相比IL-1β组，不同浓度RES(6.25～100 μmol·L-1)处理后，NF-κBmRNA表达均降低(P<0.01)。

3 讨 论

软骨组织由软骨细胞、基质及胶原纤维构成。软骨细胞是软骨组织的唯一细胞成分，软骨细胞可以产生大量Ⅱ型胶原和蛋白多糖。其中Ⅱ型胶原主要存在于软骨，而蛋白多糖呈酸性，可被碱性染料甲苯胺蓝染成蓝紫色。本实验结果显示:经Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色，培养的软骨细胞胞浆呈棕黄色；甲苯胺蓝染色细胞呈蓝紫色，软骨细胞内及细胞周围有蓝紫色异染颗粒。证实了本实验所培养的细胞为软骨细胞。

IL-1β为多肽类物质，目前已作为建立体外OA模型的诱导剂而广泛使用。本实验加入10 ng·ml-1IL-1β预先孵育软骨细胞1 h，诱导OA。RES属非黄酮类多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡等作用。本实验通过MTT法确定RES对软骨细胞无抑制作用的浓度。我们实验结果表明，0.1%DMSO和RES(6.25～100 μmol·L-1)对细胞增殖均无抑制作用，其中低浓度的RES(6.25～12.5 μmol·L-1)能促进细胞增殖。Csaki等[7]研究显示，RES浓度在50 μmol·L-1时能促进人软骨细胞的增殖。本实验结果与Csaki等研究结果存在差异，可能原因是Csaki等实验细胞提取自正常人的关节，而本实验细胞来自肥胖OA患者，细胞本身已发生退变，退变的OA细胞对RES较敏感，即低剂量的RES就能增强细胞活力。当用IL-1β预先孵育软骨细胞1 h后，细胞活力明显降低，提示10 ng·ml-1IL-1β对细胞增殖有抑制作用。

TNF-α是一种多功能的炎症细胞因子，对关节软骨具有一定的破坏作用。研究发现，TNF-α不仅能诱导其他细胞因子如IL-1、单核粒细胞刺激因子的产生，加重炎症反应[8]，还能诱导基质金属蛋白酶的表达，导致关节软骨的损伤[9]。在一项对心肌细胞缺氧/复氧损伤的研究中发现，RES浓度在5 μmol·L-1时就能抑制TNF-α[10]。本实验研究结果显示，10 ng·ml-1IL-1β能明显刺激人关节软骨细胞分泌TNF-α，提示该浓度的IL-1β作为OA体外模型诱导剂可以发挥促炎症作用；加RES后TNF-α均下降，说明RES抑制了IL-1β诱导的OA软骨细胞分泌TNF-α，提示RES具有抗OA效应。

TLR4是一类跨膜受体，可通过识别病原相关分子模式激活信号转导途径，诱导炎症细胞因子表达，引发炎症反应。Schelbergen等[11]研究发现，OA患者软骨细胞TLR4mRNA的表达高于非OA患者，且钙结合蛋白S100A8及其伴侣S100A9可通过TLR4来影响OA患者软骨细胞的分解代谢，表明TLR4在OA的发生、发展中发挥重要作用。NF-κB在TLR4信号通路下游处于中心位置。NF-κB被激活后进入细胞核内，与相应靶序列结合，调节炎症因子如TNF-α、IL-6等的表达[12]。研究发现，NF-κB信号通路的激活能促进基质金属蛋白酶基因及蛋白表达，导致细胞外基质损伤和关节软骨降解[13]。本研究结果显示:经IL-1β诱导后TLR4、NF-κBmRNA表达均显著升高，提示OA时软骨细胞的TLR4/NF-κB信号通路可能被激活；软骨细胞经RES处理后，TLR4、NF-κBmRNA均显著降低，提示RES可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路发挥抗OA作用，且随着RES浓度的增加，这种抗OA的作用也越显著。

综上所述，我们的研究结果初步提示在肥胖OA关节软骨细胞中，RES可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路发挥抗OA效应。但是，本实验只检测了mRNA的表达，将来的研究要通过对蛋白表达进行检测，以及通过小RNA干扰研究进一步证实该通路的存在。

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Effect of resveratrol on chondrocytes from obese osteoarthritic patients and the expression of TLR4 and NF-κB mRNA

JIAO Yong-liang1，LIU Hui-min1，2，GU Hai-lun3，LI Ke-yu1，LI Xing-yao1，YU Xiao-lu1，LIU Li1

(1.DepartmentofNutritionandFoodHygiene，SchoolofPublicHealth，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China; 2.NeimengguCenter,EndemicDiseaseControl，Huhehaote010030，China; 3.DepartmentofOrthopedics，ShengjingHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110004，China)

Objective: To investigate whether resveratrol can exert anti-osteoarthritic effect via the TLR4/NF-κB signaling pathway. Methods: Human articular chondrocytes were isolated and cultured by two-step eny matic digestion. The chondrocytes were identified by immunocytochemistry staining and toluidine blue staining. The cell viability was determined by the MTT assay. The levels of TNF-αin cell culture supernatant were measured by ELISA. The expression of TLR4 and NF-κB mRNA were examined by RT-PCR. Results: Cultured chondrocytes presented positive cells by Type Ⅱ collagen immunocytochemistry staining and toluidine blue staining. MTT assay showed that resveratrol (6.25-100 μmol·L-1) had no discernable inhibition effects on chondrocytes cultured in the presence or absence of IL-1β. At 6.25 and 12.5 μmol·L-1， resveratrol significantly stimulated chondrocyte proliferation. In addition， viability of cells exposed to IL-1β(10 ng·ml-1) was significantly impaired but not in the presence of resveratrol (6.25-12.5 μmol·L-1) (P<0.05). The level of TNF-αand the expression of TLR4 and NF-κB mRNA were significantly upregulated in the presence of IL-1β(10 ng·ml-1) (P<0.01) compared with control group， while resveratrol (6.25-100 μmol·L-1) treatment could dramatically downregulate TNF-αlevels and TLR4 and NF-κB mRNA expression (P<0.01). Conclusion: The anti-inflammatory effect of resveratrol on human articular chondrocyte may at least partly via the inhibition of the TLR4/NF-κB signaling pathway.

chondrocytes; resveratrol; toll-like receptor 4; osteoarthritis; obesity

2014-12-25

2015-02-10

国家自然科学基金(81372971)、辽宁省自然科学基金(201202267)资助项目

焦永亮(1988-)，男，满族，吉林梅河口人，在读硕士研究生。E-mail:jiaoyongliang075@163.com

刘莉 E-mail:liuli@mail.cmu.edu.cn

焦永亮，刘慧敏，顾海伦，等.白藜芦醇对肥胖者骨性关节炎软骨细胞的作用及对TLR4、NF-κBmRNA表达的影响[J].东南大学学报:医学版，2015，34(3)：342-346.

R151.2

A

1671-6264(2015)03-0342-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.002