前列腺癌中Sp1通过PKM2途径促进细胞增殖代谢

刘大闯，梁清，陶陶，黄烨清，许斌，陈恕求，张治国，董洋，韩从辉，陈明

(1.东南大学附属徐州市中心医院 泌尿外科，江苏 徐州 221009；2.东南大学附属中大医院 泌尿外科，江苏 南京 210009；3.东南大学医学院 外科中心实验室，江苏 南京 210009)

·论 著·

前列腺癌中Sp1通过PKM2途径促进细胞增殖代谢

刘大闯1，2，3，梁清1，陶陶2，3，黄烨清2，3，许斌2，3，陈恕求2，3，张治国1，董洋1，韩从辉1，陈明2，3

(1.东南大学附属徐州市中心医院 泌尿外科，江苏 徐州 221009；2.东南大学附属中大医院 泌尿外科，江苏 南京 210009；3.东南大学医学院 外科中心实验室，江苏 南京 210009)

目的:确定前列腺癌中Sp1通过PKM2途径对前列腺癌细胞的增殖和代谢的作用。方法:前列腺癌细胞株DU145与PC3体外转染Sp1 siRNA与阴性对照无意义核苷酸序列(NC组)，采用葡萄糖检测试剂盒与乳酸检测试剂盒检测转染后有氧糖酵解变化；CCK-8实验检测转染后的细胞增殖；qRT-PCR检测转染后PKM2表达；Western Blotting检测转染后Sp1与PKM2表达。结果：DU145与PC3转染Sp1 siRNA后与NC组比较，剩余葡萄糖显著偏高，乳酸产生显著下降；CCK8实验表明抑制Sp1后能显著抑制前列腺癌细胞的增殖能力；qRT-PCR实验显示抑制Sp1后明显抑制PKM2的表达；Western Blotting显示转染的Sp1 siRNA对Sp1具有较高的沉默效率，且PKM2的表达也降低。结论：Sp1在前列腺癌细胞株DU145与PC3中可通过直接作用于PKM2促进细胞代谢。

前列腺癌；特殊蛋白1；细胞增殖；丙酮酸激酶同工酶M2型；有氧糖酵解

转录因子特殊蛋白1(specificity protein 1， Sp1)是序列特异性的DNA结合蛋白，通过Cys2His2锌指DNA结合域与GC盒(GGCGGG)和GT盒(CACCC)结合，可调控下游基因启动子中富含GC序列的细胞和病毒基因的转录过程[1]。丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase，PKM2)是PK的4种同工酶之一,又称胚胎型PK，源于PKM基因独特的选择性剪切。PKM基因定位于15q22，由12个外显子和11个内含子组成，M1型与M2型的差异在于转录后外显子的选择性剪接加工，M2型同工酶保留10号外显子，M1型同工酶保留9号外显子，两种同工酶间有21个氨基酸的差异[2]。PKM2被认为是原型，在个体发育分化时骨骼肌、肝和红细胞中逐渐分别被M1型、L型和R型同工酶取代[3]。但在肿瘤发生过程中，PKM2重新表达以促进肿瘤细胞增殖，并且多以具有活性的二聚体形式存在。肿瘤细胞即便是在氧供应充足情况下仍产生大量乳酸，这种在有氧条件下仍将葡萄糖转化为乳酸的现象称为有氧糖酵解，又称Warburg效应[4]。糖酵解的上调导致肿瘤细胞微环境的酸毒性对正常细胞有明显抑制作用，而对抗酸性较强的肿瘤细胞来说能助其增殖和浸润。PKM2在包括前列腺癌在内的几乎所有的肿瘤中表达均增加。有研究表明，Sp1可能促进PKM2的表达[5]。关于肿瘤代谢的研究日益受到重视，本研究旨在确定前列腺癌中Sp1通过PKM2途径对前列腺癌的增殖和代谢的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞系 人前列腺癌细胞株DU145与PC3细胞(来自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心)。

1.1.2主要试剂 RPMI 1640培养基，0.25%胰蛋白酶(Gibco 公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；青霉素-链霉素双抗生素(上海捷瑞生物公司)；Sp1 小干扰RNA(Sp1 siRNA):正义链5′-GGUCAGUUGGCAGACUCUATT-3′，反义链5′-UAGAGUCUGCCAACUGACCTT-3′,PKM2的上游引物序列:5′-CGCCTGGACATTGATTCA-3′，下游序列:5′-GTTCAGACGAGCCACATT-3′(均由上海吉玛制药技术有限公司合成)；Opti-MEM培养基、脂质体转染试剂Lipofectamine 2000、Trizol(Invitrogen公司)；SYBR Green染料法逆转录实时定量PCR试剂盒(PrimeScriptOne-Step RT-PCR Kit， Takara公司)；CCK-8 Kit、BCA蛋白浓度检测试剂盒、RIPA(强)蛋白裂解液(中国碧云天生物技术研究所)；葡萄糖分析试剂盒、乳酸分析试剂盒(BioVision公司)；兔抗人SP1一抗(Cell Signaling Technology公司)；兔抗人PKM2一抗(Santa-Cruz Biotechnology公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；聚偏氟乙烯PVDF膜(Millipore公司)；溴酚蓝，吐温-20(Sigma公司)；Tris-base，十二烷基硫酸钠(SDS)，丙烯酰胺(BioSharp公司)；过硫酸铵(Promega公司)；预染蛋白分子量Marker(Fermentas公司)；Cocktail蛋白酶抑制剂混合物(Merck公司)；四甲基二乙胺(TEMED)(Amresco公司)；ECL发光检测试剂盒(Millipore公司)；甲醇(广东汕头市西陇化工厂)。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养及转染 以含10%胎牛血清、1%青-链双抗的RPMI 1640完全培养基在37 ℃、5% CO2、95%饱和湿度的细胞培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化细胞，每周传代2～3次。选择对数生长期DU145与PC3细胞，转染前1 d以0.25%胰蛋白酶消化细胞， 800 r·min-1离心3 min，以无抗生素RPMI 1640培养基制成单细胞悬液(6×105孔-1)接种于的6孔培养板中(每孔含2 ml不含抗生素的完全培养基)，细胞密度约为5×104ml-1，24 h内在37 ℃、5%CO2条件下培养至细胞融合约60%左右可以用于转染，将4 μg Sp1 siRNA和4 μg 阴性对照无意义核苷酸序列(NC)分别加入250 μl Opti-MEM 培养基中，吹匀；将5 μl Lipofectamine 2000加入另一250 μl Opti-MEM培养基，吹匀；5 min后，将两管液体混匀，室温放置30 min；将上述500 μl 混合物加入6孔板中，摇匀；将6孔板置入37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养。

1.2.2葡萄糖及乳酸代谢实验 采用特制葡萄糖、乳酸代谢检测用24孔板。每孔加培养基200 μl，转染后12 h的DU145和PC3细胞胰酶消化后制成单细胞悬液，每孔种细胞10 000个，放入细胞培养箱以37 ℃、5%CO2培养72 h后，按照葡萄糖分析试剂盒及乳酸分析试剂盒说明，收集细胞上清液培养基，测量OD值。根据按照细胞数规格化的标准曲线计算出所剩余的葡萄糖含量和所产生的乳酸的量。

1.2.3CCK-8实验 96孔培养板每孔接种2 000个细胞，按转染试剂说明操作分别加入转染混合液100 μl·孔-1，6 h后换为完全培养基，37 ℃、5% CO2条件下继续培养。分别于转染后24、48、72和96 h向每孔加入10 μl CCK-8溶液，在培养箱内孵育2 h后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，每组设5个复孔。

1.2.4逆转录荧光实时定量多聚酶链反应(qRT-PCR) 转染48 h后Trizol法提取细胞总RNA，PKM2 mRNA检测采用SYBR Green染料法逆转录实时定量PCR试剂盒，在ABI7300定量PCR仪上进行PCR扩增，以GAPDH为内参，2-ΔΔCT法计算PKM2 mRNA的相对表达量。

1.2.5Western Blotting(WB)检测蛋白表达 通过Western blotting检测DU145 和PC3 细胞中Sp1与PKM2蛋白表达。提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，加入5×上样缓冲液，100 ℃加热5 min变性，冷却备用。取蛋白样品50 μg和Marker 5 μl 上样，80 V 40 min、120 V 120 min 电泳后，转膜，5%脱脂奶封闭，一抗孵育过夜，洗膜30 min，二抗孵育60 min，洗膜30 min，曝光，通过目的蛋白条带和内参(GAPDH)条带灰度值计算相对表达量。

1.3 统计学处理

每组实验重复3次，数据采用SPSS 16.0软件处理。组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 葡萄糖分析试剂盒检测DU145与PC3消耗葡萄糖能力

与NC组比较，前列腺癌细胞株DU145与PC3体外转染Sp1 siRNA后，剩余葡萄糖含量显著偏高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 乳酸分析试剂盒检测DU145与PC3产生乳酸的能力

与NC组相比，前列腺癌细胞株DU145与PC3体外转染Sp1 siRNA后产生乳酸能力显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

与NC组比较，aP<0.05

图1 DU145与PC3葡萄糖消耗能力检测

与NC组比较，aP<0.05

图2 DU145与PC3产生乳酸的能力检测

2.3 CCK-8实验检测DU145与PC3细胞活性和增殖能力

转染NC与Sp1 siRNA后分别于24、48、72和96 h向每孔加入10 μl CCK-8溶液，在培养箱内孵育2 h后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，结果显示，Sp1 siRNA明显抑制前列腺癌的细胞活性和增殖能力。见图3。

2.4 qRT-PCR检测DU145与PC3的 PKM2表达

与NC组比较，前列腺癌细胞株DU145与PC3体外转染Sp1 siRNA后， PKM2 mRNA的表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

与NC组比较，bP<0.01

图3 DU145与PC3细胞活性和增殖能力检测

与NC组比较，bP<0.01

图4 DU145与PC3的 PKM2表达检测

2.5 Western Blotting实验检测Sp1的表达

转染Sp1 siRNA组与转染NC组相比，转染Sp1 siRNA后Sp1的表达明显降低，表明本研究所采用筛选出的Sp1 siRNA 具有较高的沉默效率。见图5。

图5 转染Sp1 siRNA后Sp1检测检测

转染Sp1 siRNA后PKM2的表达显著降低，表明Sp1与PKM2具有协同性，Sp1可以促进PKM2的表达。见图6。

图6 转染Sp1 siRNA后PKM2表达的检测

3 讨 论

目前，对去势抵抗性前列腺癌仍无特效的治疗手段[6]，因此，对去势抵抗性前列腺癌的增殖代谢研究有重要临床意义。本研究结果显示:在去势抵抗性前列腺癌细胞株DU145与PC3中体外转染Sp1 siRNA后，与NC组相比，剩余葡萄糖含量明显偏高(P<0.05)，乳酸的产生显著下降(P<0.05)，表明Sp1在前列腺癌中起到促进细胞代谢的作用。CCK-8实验结果也表明在前列腺癌细胞中抑制Sp1则抑制了细胞增殖能力，说明Sp1在前列腺癌中具有重要的促癌作用[7-9]。为了更好地研究人转录因子Sp1，有学者使用大肠杆菌的原核表达系统寻找到一种能够快速、高效表达并且纯化出Sp1蛋白的方法[10]，为我们今后进一步的研究提供支持。qRT-PCR检测结果显示，抑制Sp1后能够明显抑制PKM2的表达；Western Blotting检测结果显示，转染Sp1 siRNA后Sp1表达显著降低，表明我们实验所选用的Sp1 siRNA具有较高的沉默效率，并且伴随着PKM2的表达显著降低，通过qRT-PCR与Western Blotting两种实验方法，从mRNA及蛋白水平验证抑制Sp1可抑制PKM2的表达。PKM2被认为是原型，在肿瘤发生、发展过程中PKM2重新表达,以具有活性的二聚体的形式存在较多，促进肿瘤细胞的增殖和代谢。肿瘤细胞在氧供应充足情况下仍产生大量乳酸提示肿瘤的高代谢活性。肿瘤代谢是目前研究的热点之一，人们期望通过阐明肿瘤高代谢的机制，以控制肿瘤代谢中的关键物质为靶点，为开辟治疗肿瘤的新途径提供理论和实验依据。

目前，PKM2在前列腺癌中的作用已被逐渐认识，PKM2能够调节前列腺癌的葡萄糖代谢[11]。肿瘤细胞通常表达的PKM2可导致新陈代谢从氧化磷酸化转向有氧糖酵解和肿瘤发生，高葡萄糖浓度可刺激PKM2的305位赖氨酸乙酰化，乙酰化突变的作用是积累糖酵解中间体和促进细胞增殖和肿瘤生长[12]。

有研究证实，在淋巴结转移的前列腺癌组织中PKM2的表达明显高于局灶原发性前列腺癌组织，Gleason 8-10的前列腺癌组织中PKM2的表达明显高于Gleason 6-7的前列腺癌；前列腺癌干细胞样细胞被认为具有更高的恶性度，更加具有侵袭与转移特性的前列腺癌干细胞样细胞中PKM2的表达比非前列腺癌干细胞样细胞明显增高，认为PKM2的上调与前列腺癌的进展有关[13]。有研究表明，miR-124可通过靶向调控抑制PKM2 基因的表达从而抑制前列腺癌PC3细胞的增殖[14]，抑制PKM2可增强前列腺癌PC3细胞对藤黄酸诱导细胞凋亡的敏感性[15]。因此，PKM2在前列腺癌中的作用越来越受到重视。

综上所述，我们发现Sp1在前列腺癌中起到重要的促癌作用，Sp1可通过PKM2途径促进前列腺癌的增殖和代谢。进一步明确了Sp1、PKM2在前列腺癌中相互调控的分子机制，为以Sp1、PKM2为靶点治疗前列腺癌提供了理论依据， 为以后监测前列腺癌的发生、发展和治疗的有效药物开发提供依据。但Sp1与PKM2的具体机制仍需要我们进一步研究，我们推测在前列腺癌中Sp1可能与PKM2 的启动子区域结合，从而促进PKM2的表达，需要我们进一步的探索明确。

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Sp1 promotes cell metabolism and proliferation through PKM2 pathway in prostate cancer

LIU Da-chuang1，2，3，LIANG Qing1，TAO Tao2，3，HUANG Ye-qing2，3，XU Bin2，3，CHEN Shu-qiu2，3，ZHANG Zhi-guo1， DONG Yang1， HAN Cong-hui1， CHEN Ming2，3

(1.DepartmentofUrology，XuzhouCentralHospital，AffiliatedtoSoutheastUniversity，Xuzhou221009，China;2.DepartmentofUrology，ZhongdaHospitalAffiliatedtoSoutheastUniversity，Nanjing210009，China;3.SurgeryCentralLaboratory，SchoolofMedicineSoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To determine wether the Sp1 could accelerate the metabolism of prostate cancer cells through PKM2.Methods: DU145 and PC3 cell lines of prostate cancer were transfected with Sp1 siRNA or NC. Aerobic glycolysis was detected by the glucose and lactic acid detection kit after transfection. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay. PKM2 mRNA expression was detected by qRT-PCR. Sp1or PKM2 expression was tested by Western Blotting. Results: The remaining glucose level was higher in Sp1 siRNA group than in NC group， the lactic acid level declined significantly after Sp1 siRNA transfection. CCK-8 assay revealed over-expression of Sp1 siRNA significantly inhibited proliferation. qRT-PCR showed that the inhibition of Sp1 could significantly inhibit the expression of PKM2. Western Blotting showed that Sp1 had high efficiency of silence， PKM2 expression reduced significantly after Sp1 siRNA reansfection.Conclusion: Sp1 acts directly on PKM2 to promote cell metabolism in DU145 and PC3 cell lines of prostate cancer.

prostate cancer; specificity protein 1; cell proliferation; pyruvate kinase isoenzyme type M2; aerobic glycolysis

2014-12-18

2015-01-12

国家自然基金(81370849、81300472、81272557、81202034)、临床医学科技专项——新型临床诊疗技术攻关基金(BL2013032)、教育部博士点基金(20120092120071)、江苏省自然科学基金(BK2012336、BK2012647)、南京市科技发展基金(201201053)、江苏六大人才高峰基金(WSW-067)、江苏省普通高校研究生科研创新计划基金(CXZZ13_0133)和中央高校基本科研业务费专项基金资助项目

刘大闯(1980-)，男，安徽亳州人，在读博士研究生，主治医师。E-mail:ldc_32357@126.com

陈明 E-mail:mingchenseu@gmail.com; 韩从辉 E-mail:conghuiseu@126.com

刘大闯，梁清，陶陶，等.前列腺癌中Sp1通过PKM2途径促进细胞增殖代谢[J].东南大学学报：医学版，2015，34(3)：337-341.

R737.25

A

1671-6264(2015)03-0337-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.001