人乳头瘤病毒疫苗预防宫颈癌的应用

夏巧凡，何莲芝

宫颈癌是一种严重危害女性身心健康的恶性肿瘤，全球每年新发病例约50万，死亡约25万例，其中约80%的病例出现在发展中国家[1]。随着宫颈癌筛查制度的建立，其发病率和死亡率有所下降，但在一些发展中国家及地区宫颈癌仍是威胁妇女健康的重要疾病之一，且呈年轻化趋势。宫颈癌的防治一直是世界各国尤其是发展中国家的重点研究内容之一，世界卫生组织（WHO）也把宫颈癌的防治纳入各国公共卫生状况考核内容。20世纪80年代zur Hausen首次研究发现人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）与宫颈癌有关，现已明确持续性高危型HPV感染是宫颈癌发生的必要因素[2]。目前人类已研制出预防HPV感染的疫苗并通过临床试验已在全球范围内推广上市。通过接种疫苗、定期筛查、早诊断、早治疗以及严密随访，宫颈癌有望成为人类抗肿瘤史上第一个可以预防的癌症。

1 HPV感染与宫颈癌的关系

1.1 HPV的生物学特征 HPV是一种嗜上皮性双链环状DNA病毒，由7800～7900个碱基对组成，是一种没有包膜的病毒颗粒。其基因组按功能分为早期转录区（E区）、晚期转录区（L区）和非编码区。E区包括编码 E1、E2、E4、E5、E6、E7 蛋白的开放读码框（open reading frame，ORF），主要调控染色体外的DNA复制，表达于宫颈细胞的基底层、基底上层和中间层。E1在染色体复制过程中调节DNA的复制；E2在维持病毒基因游离形式和启动其转录中起重要作用；E4在整个上皮层均有表达，通过破坏细胞骨架使病毒颗粒从分化细胞中游离出来，促进病毒颗粒的装配和释放，但E4的潜在功能仍有待进一步研究；目前研究发现E5有修饰生长因子受体的功能；E6和E7是病毒癌基因，在低危型HPV中不表达或弱表达，相反在高危型HPV中，一旦病毒基因组整合到宿主细胞基因组就进行转录翻译。E6与抑癌蛋白p53结合使细胞滞留在S期，阻碍细胞凋亡；E7与抑癌蛋白pRb结合，使其降解并诱导上皮组织恶性变[3]。L区包括编码L1、L2蛋白的ORF，负责编码衣壳蛋白，在顶端组织层才被激活进行转录。L1的基因序列具有高度保守性，编码病毒的主要衣壳蛋白，具有在体外自我组装成病毒样颗粒（virus like particle，VLP）的特性，机体通过体液免疫反应产生对抗HPV VLP的中和抗体。L2编码病毒的次要衣壳蛋白，大部分L2在壳内，只有小部分暴露在表面。非编码区主要通过控制ORF的转录来调节病毒蛋白和病毒颗粒的产生。因此，L1蛋白成为第一代预防性HPV疫苗的靶分子，目前学者们已着手以L2蛋白为靶抗原进行新一代HPV疫苗的研究。

1.2 HPV感染的致病机制 HPV通过机体的细微损伤与基底膜上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparin sulfate proteoglycan，HSPG）结合，HSPG属于糖胺聚糖家族，具有组织特异性，在基底膜和基底细胞中均有表达，L1蛋白表面有HSPG受体结合位点。HPV与HSPG的相互作用导致病毒衣壳发生构型变化，随后弗林蛋白酶（Furin）裂解HPV的L2，使L1的细胞受体结合位点暴露，与此同时，病毒衣壳与HSPG之间的亲和力减弱，经此变化的HPV病毒颗粒从基底膜转移到角质细胞[4-5]。另有研究报道HPV最先感染基底细胞[6]，至于HPV最先感染基底膜还是基底细胞或HPV在两者之间又存在怎样的转移机制仍有待进一步研究。发生构型变化的HPV病毒颗粒利用溶酶体相关膜蛋白（lysosome-associated membrane proteins）将病毒颗粒转移到细胞核内体，然后病毒脱去衣壳，因其不能编码聚合酶和HPV复制所需要的其他酶类，在L2蛋白的辅助下感染的HPV基因组脱离核内体，在有丝分裂期间借助微管移向细胞核，并与宿主细胞的基因组发生融合，在感染细胞的子代细胞内复制蛋白的辅助下完成HPV基因组复制[4]。此外，HPV的生命周期还依赖上皮细胞的分化，只有在角质细胞中HPV的晚期转录区才开始编码L1和L2蛋白，进入细胞核包裹HPV基因组，即完成HPV病毒颗粒的组装。角质层中可见典型的HPV相关细胞病理变化，如挖空细胞、核分裂相增多、细胞核增大。随着上皮细胞的脱落，完成组装的HPV病毒颗粒被释放出来重新启动下一个感染周期[5]。

并非所有的HPV感染都导致细胞异常增生或恶性变。大多数HPV感染最终均能被机体内的细胞和体液免疫机制清除，大量体外试验检测到宫颈癌细胞系中高危型HPV包含E6和E7基因在内的基因与宿主细胞基因组发生整合并持续转录翻译，表明HPV E6和E7基因中的1种或2种持续表达是高危型HPV感染致瘤的关键[7-8]。E6和E7蛋白分别通过与p53和pRb结合，导致p53、pRb功能失活降解，这一过程对于最终的癌性转化是必要而非充分条件，但E6和E7蛋白附加的致癌性促进宿主细胞无限增殖并向恶性转化[9]。因此，E6和E7蛋白将成为今后HPV治疗性疫苗的主要靶抗原。

2 预防性HPV疫苗的应用研究

2.1 预防性HPV疫苗的类型

2.1.1 已上市的预防性HPV疫苗 自2006年首批HPV疫苗上市以来已有2种HPV预防性疫苗被美国食品与药品管理局（FDA）认证上市，即针对HPV16/18型的二价疫苗Cervarix和针对HPV16/18/11/6型的四价疫苗Gardasil。目前上市的2种预防性HPV疫苗的抗原均是通过体外基因重组技术使L1蛋白在表达系统中自行包装成与天然病毒类似的类病毒颗粒，这种重组的L1蛋白产生的VLP在形态上与HPV颗粒无区别，因所含的构象表位相同，其抗原性与自然界中感染的HPV基本相似。但该种重组VLP不含有HPV DNA，故具有非感染性及非致癌性[10]。机体接种疫苗后，产生的抗体滴度是自然感染的20～80倍[6]，主要分布在血液和子宫黏膜的分泌液中，其可以阻止HPV附着在基底膜上[11]。2种疫苗均通过添加佐剂来增强其免疫效果，Gardasil中加入含铝佐剂，Cervarix中加入含AS04佐剂，该佐剂是由细菌胞壁成分单磷酰脂质A（monophosphoryl lipid A）构成，两者免疫途径均为肌内注射，前者需在第0，2，6个月各接种1次，后者接种时间是第0，1，6个月各接种1次。

2.1.2 新一代预防性HPV疫苗 新一代HPV预防性疫苗注重考虑疫苗的成本、持久性和广谱免疫问题。研究显示在L2蛋白氨基酸的氨基末端有交叉中和表位，据此推测可利用单一抗原研制出广谱免疫效应的疫苗[12]。最近有研究者制备出一种能表达HPV16 L2蛋白的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），通过口服免疫诱导Balb/c小鼠产生针对HPV16的中和抗体，同时可对HPV18，45和58也产生交叉免疫[13]。这可以解决已上市疫苗制备成本昂贵及广谱免疫问题，但是这些动物模型产生的抗体滴度较弱，且无法进一步研究HPV型别间的血清学反应。然而利用HPV假病毒颗粒（HPV pseudovirion，PsV）可以使抗L2免疫原的抗血清有效中和不同的HPV型别[14]。此外，研究者们希望通过能表达L2的HPV L1-VLPs重组疫苗诱导产生高滴度的交叉中和抗体，但目前的研究结果均不理想[5]。有研究也以L1衣壳为平台尝试制备出一种HPV16 L1△L2X3疫苗，尽管可以降低生产成本，但抗体浓度仍较低[15]。另有一项研究利用DNA重组技术将L2的部分区域表达于马铃薯X病毒（patato virus X，PVX）外壳蛋白中，该研究设计出来的L2108-120-PVX CP疫苗除了廉价、可进行大批量生产等优点外，更重要的是因为表达的植物蛋白可以使疫苗免于病原物毒素的污染，以增加疫苗的安全性[16]。近年研究发现噬菌体PP7颗粒可能是一种潜在的内源性佐剂，在激动Toll样受体中起重要作用，因此以噬菌体PP7为载体研制的L2-PP7混合疫苗显示出很好的发展前景[17]。鉴于HPV主要通过黏膜组织侵犯机体，目前也开始尝试针对病毒的黏膜型抗体的研发[18]。

2.2 预防性HPV疫苗的适用对象 Gardasil疫苗最初适用于9～26岁的女性，主要用来预防HPV16或18感染引起的宫颈癌和HPV6或11导致的生殖器疣，后来被延伸用来预防外阴、阴道及肛门部位的癌症，目前也推荐用于9～26岁的男性。Cervarix疫苗适用于10～25岁的女性，用于预防HPV16或18感染引起的宫颈癌或与此相关的癌前病变[19]。年龄的限制并不是绝对的，关键是有无性生活，HPV疫苗对于无性生活史的女性效果最佳。欧洲国家的一些流行病学资料显示，HPV也可引起男性与多种HPV感染相关的良恶性肿瘤，包括肛门癌、阴茎癌、头颈部肿瘤以及生殖器疣[20]。目前各界专家越来越支持对男性进行HPV疫苗免疫[21-22]。由于没有足够的数据支持，目前并不推荐妊娠妇女接种HPV疫苗。

2.3 预防性HPV疫苗的有效性与安全性 从目前国外对上市后HPV疫苗效果的密切监测结果来看，HPV疫苗对预防宫颈癌前病变及宫颈癌是安全有效的[23-24]。Cervarix疫苗由于含独特佐剂，具有交叉免疫效应，可以预防98%的宫颈上皮内瘤样病变Ⅲ级（cervical intraepithelial neoplasiasⅢ，CINⅢ） 以及100%预防原位腺癌（adenocarcinoma in situ，AIS）[25]。Gardasil疫苗预防异性恋和同性恋男性的生殖器疣的有效率分别为92.4%和79%[26]，Gardasil疫苗还被证实可预防与HPV感染相关的外阴或阴道上皮内瘤变[12]以及男性的高级别肛门疾病[27]。最新一项研究显示，HPV疫苗除了能有效预防年轻女性患宫颈癌外，还能有效预防多种口咽部癌症[10]。Gardasil疫苗和Cervarix疫苗的免疫保护期限分别是6.4年和8.4年[19]，2种HPV疫苗最常见的不良反应是注射部位的局部炎症反应，严重不良反应包括格林-巴利综合征（GBS）、晕厥、静脉血栓等的发生率很低，且与安慰剂组差异无统计学意义，目前暂无因注射2种疫苗而引起死亡的病例报道[28]。

3 预防性HPV疫苗的推广和面临的问题

WHO正在积极推进HPV疫苗全球接种计划的实施，但目前研制出的HPV预防性疫苗具有型别特异性，随着其在世界范围内推广使用，会凸显其他型别HPV感染引起的宫颈癌的发生。研发更多价数的HPV疫苗是将其纳入免疫计划中不可忽视的问题之一。目前HPV疫苗的费用大约在2000～3000元，其高昂的费用对宫颈癌负担很重的发展中国家来说无疑是推广的一大障碍。因此，新一代HPV疫苗主要致力于研发广谱、廉价、高效的疫苗，从源头预防宫颈癌，同时为与HPV感染有关的其他癌症的预防奠定基础。

目前中国HPV疫苗尚处于临床试验阶段，影响HPV疫苗迟迟在中国应用的原因除了经济因素，还有如何选择科学合理的临床终点以加速疫苗预防效果的评估。目前各界专家对持续性HPV感染作为终点来评价HPV预防性疫苗临床试验的有效性已达成共识。希望这能加速HPV疫苗在中国的上市进程，使中国女性早日享受到这一人类科学进步的成果。

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