TLR3在宫颈HPV16持续性感染及宫颈病变中的作用

唐荣荣，刘佳佳，刘荣，张丽志，罗远材，瞿全新

TLR3在宫颈HPV16持续性感染及宫颈病变中的作用

唐荣荣，刘佳佳，刘荣，张丽志，罗远材，瞿全新

目的：探讨Toll样受体3（TLR3）在宫颈人乳头瘤病毒16（HPV16）持续性感染及宫颈病变中的作用。方法：选取宫颈液基细胞学检查正常的HPV16阳性者157例，其中40例6个月后复查仍为HPV16阳性（HPV16持续感染组），117例6个月后复查转为阴性（HPV16非持续感染组）。同时选择同期就诊的宫颈HPV16阳性、临床病理资料完整的宫颈疾病患者共206例，其中A组119例（慢性宫颈炎102例、CINⅠ17例）、B组66例（宫颈CINⅡ～Ⅲ57例，原位癌9例）和C组21例（宫颈浸润癌）。以聚合酶链反应（PCR）方法检测TLR3及β干扰素（IFN-β）DNA相对表达量，应用基因测序方法进行TLR3基因突变分析。结果：HPV16持续感染组TLR3、IFN-β DNA相对表达量低于HPV16非持续感染组（均P＜0.05）。HPV16持续感染组与非持续感染组TLR3与IFN-β DNA相对表达量均呈正相关（均P＜0.001）。在HPV16持续感染组与非持续感染组中均未检测到TLR3扩增片段的基因突变。HPV16阳性宫颈病变的3组患者TLR3及IFN-β DNA相对表达量差异有统计学意义（均P＜0.05）。TLR3、IFN-β DNA相对表达量均为A组高于B组及C组（均P＜0.05），B组高于C组（P＜0.05）。在不同级别宫颈病变中TLR3与IFN-β DNA相对表达量呈正相关（均P＜0.001）。结论：TLR3可能通过调控IFN-β表达而调节宫颈局部免疫功能，TLR3表达减低不仅与宫颈HPV16持续性感染有关，而且在宫颈癌前病变及宫颈癌发生及进展中发挥重要作用。

宫颈肿瘤；人乳头瘤病毒16；感染；Toll样受体3；干扰素β

【Abstract】Objective:To explore the role of TLR3 in HPV16 persistent infection and cervical lesions.Methods：Collected 157 cases HPV 16 infected patients whose liquid-base cervical cytology report is no intraepithelial lesion or malignancy（NILM）. After 6 months observation，among them，40 cases were detected HPV16 persistent infection（persistent infection group），and the other 107 cases turned to be negative（non-persistent infection group），meanwhile selected 206 cases HPV 16 infected patients and split them with different stages of cervical lesions into three groups:group A contains 119 cases（chronic cervicitis 102 cases and CINⅠ17 cases）；group B contains 66 cases（CINⅡ-Ⅲ57 cases and carcinoma in situ 9 cases）；group C contains 21 cases （cervical carcinoma 21 cases）.The expression of DNA TLR3 and IFN-β were detected by PCR.The mutation of TLR3 recycled productions were detected by gene sequencing respectively.Results：The expression levels of TLR3，IFN-β in persistent infection group were lower than those in non-persistent infection group，and the differences were statistically significant（P＜0.05）.TLR3 was positively correlated with IFN-β，which has statistically significant（P＜0.001）.The expressions of TLR3，IFN-β in different cervical lesions groups:in group A，B and C，the expression levels of TLR3 group A was higher than group B and group C（P＜0.05）；the expression levels of group B was higher than group C（P＜0.05）.The expression levels of IFN-β group A was higher than group B and group C（P＜0.05）；the expression levels of group B was higher than group C（P＜0.05）.In three groups TLR3 was positively correlated with IFN-β，which has statistically significant（all P＜0.001）.Conclusions：The low expression level of TLR3 leads to cervical local immune dysfunction by down-regulating the expression of IFN-β.The reduction of TLR3 expression is not only related with the cervical HPV 16 persistent infection but also plays an important role in regulating the occurrence and progression of cervical lesions and cervical cancer.

【Keywords】Uterine cervical neoplasms；Human papillomavirus 16；Infection；Toll-like receptor 3；Interferon-beta

（J Int Obstet Gynecol，2015，42：445-448）

高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是导致宫颈癌前病变及宫颈癌的必要因素，但是导致宫颈高危型HPV持续感染的原因还不清楚。有研究表明，宫颈局部固有免疫功能降低与高危型HPV持续感染、宫颈病变密切相关。女性生殖道黏膜上皮细胞表达Toll样受体3（TLR3），参与局部黏膜抗细菌、病毒等病原感染的固有免疫应答。目前TLR3抗病毒机制尚不明确，可能与其识别HPV并激活宫颈局部抗病毒免疫应答、影响β干扰素（IFN-β）信号转导有关。本研究旨在探讨TLR3在宫颈HPV16持续感染及宫颈癌与癌前病变中的作用及其机制。

1　资料与方法

1.1临床资料选取2009年1月—2013年12月于天津市第一中心医院（简称我院）行宫颈液基细胞学检查正常的HPV16阳性者157例，年龄27～69岁，未予治疗，随访观察6个月后复查，其中40例HPV16仍呈阳性（HPV16持续感染组），年龄22～59岁，平均（38.16±10.38）岁；117例转为阴性（HPV16非持续感染组），年龄27～58岁，平均（40.42±7.13）岁。2组患者年龄差异无统计学意义（t=0.298，P=0.776），取宫颈脱落细胞前均未经任何治疗。同时选择同期就诊于本院的宫颈HPV16阳性、临床病理资料完整的宫颈疾病患者共206例，根据病理检查结果分为3组，A组119例（CINⅠ17例、慢性宫颈炎102例）年龄21～60岁，平均（37.50±9.87）岁；B组66例（CINⅡ～Ⅲ57例，原位癌9例）年龄27～69岁，平均（36.94±8.58）岁；C组21例（宫颈浸润癌）年龄30～61岁，平均（39.39±9.82）岁。3组年龄差异无统计学意义（F=1.003，P= 0.369），收集宫颈脱落细胞前各组患者均除外传染性疾病、肝肾疾病，均未接受手术、放疗、化疗及其他治疗。

1.2试剂及材料全基因组DNA提取试剂盒为广东凯普生物科技股份有限公司产品；聚合酶链反应（PCR）扩增试剂盒为康为世纪生物科技有限公司产品；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、乙二胺四乙酸（EDTA）均为生工生物工程（上海）股份有限公司产品；琼脂糖为美国英杰生命技术有限公司（Invitrogen）产品，PCR所需引物设计、合成由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，TLR3基因测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3方法

1.3.1PCR检测各组中TLR3、IFN-β DNA表达宫颈脱落细胞严格按照试剂盒要求提取DNA。PCR扩增体系为2× Goldstar Taq MasterMix 12.5 μL，DNase/RNase-Free H2O 8.5 μL，DNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL。反应条件：预变性95℃10 min；循环扩增35次，每个循环包括变性95℃30 s，退火59℃（β-actin、TLR3）、62℃（IFN-β）30 s，延伸72℃1 min；最后保持72℃5 min。PCR引物序列见表1。制备浓度为1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，经凝胶成像分析系统扫描，用Bio-Rad成像分析软件分析结果，目的DNA相对表达量=目的条带灰度值/β-actin条带灰度值，实验重复3次，取平均值。

1.3.2目的片段纯化、测序依照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒附带的说明书，回收目的DNA片段。回收后所得溶液重新使用琼脂糖凝胶进行电泳，验证其确为目的片段后送至上海生工生物科技有限公司进行双向测序。

1.4统计学方法使用SPSS 17.0软件进行分析，定量资料符合正态分布的数据用均数±标准差（±s）表示，2组比较行t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间多重比较应用LSD检验分析。TLR3与IFN-β DNA相对表达量的相关性采用Pearson线性相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1　PCR引物序列

2　结果

2.1HPV16持续感染组与非持续感染组中TLR3、IFN-β DNA相对表达量HPV16持续感染组TLR3、IFN-β DNA相对表达量低于HPV16非持续感染组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

表2　HPV16持续感染组与非持续感染组TLR3、IFN-β DNA相对表达量　（±s）

表2　HPV16持续感染组与非持续感染组TLR3、IFN-β DNA相对表达量　（±s）

组别　n　TLR3　IFN-β持续感染组　040　0.622±0.160　0.640±0.169非持续感染组　117　0.696±0.155　0.735±0.151 t 2.590　3.329 P 0.011　0.001

2.2HPV16持续感染组与非持续感染组TLR3与IFN-β DNA相对表达量的相关性TLR3与IFN-β DNA相对表达量散点图见图1，Pearson相关分析显示持续感染组及非持续感染组中TLR3与IFN-β DNA相对表达量呈正相关（r分别为0.674及0.659，均P＜0.001）。

2.3HPV16持续感染组与非持续感染组TLR3测序分析应用基因测序方法分析TLR3基因突变情况，结果显示TLR3在HPV16持续感染组与非持续感染组中的扩增片段均未见突变。见图2、3（见后插二）。

2.43组宫颈病变中TLR3、IFN-β DNA相对表达量比较HPV16阳性的宫颈病变的3组患者TLR3 及IFN-β DNA相对表达量差异有统计学意义（均P＜0.01）。TLR3 DNA相对表达量A组高于B组及C组（均P＜0.05），B组高于C组（P＜0.05）。IFN-β DNA相对表达量A组高于B组及C组（均P＜0.05），B组高于C组（P＜0.05）。见表3。

图1　HPV16持续感染组与非持续感染组TLR3与IFN-β DNA相对表达量散点图

表3　3组宫颈病变中TLR3及IFN-β DNA相对表达量比较　（±s）

表3　3组宫颈病变中TLR3及IFN-β DNA相对表达量比较　（±s）

组别　n　TLR3　IFN-β A组　119　0.661±0.159　0.722±0.169 B组　066　0.606±0.143　0.659±0.144 C组　021　0.507±0.160　0.483±0.143 F（P）　7.983（＜0.001）　12.163（＜0.001）组间比t（P）A∶B　02.211（0.031）　03.154（0.022）A∶C　10.849（0.000）　09.315（0.000）B∶C　06.097（0.024）　11.498（0.001）

2.5在不同级别宫颈病变中TLR3与IFN-β DNA相对表达量的相关性宫颈病变中TLR3与IFN-β DNA相对表达量散点图见图4，Pearson相关性分析显示A组、B组及C组不同级别宫颈病变中TLR3与IFN-β DNA相对表达量均呈正相关（r=0.598，P＜0.001；r=0.675，P＜0.001；r=0.619，P＜0.001）。

3　讨论

TLR3是最早发现的能特异性识别病毒双链RNA（dsRNA）的病原体相关分子模式识别受体家族成员之一，可激活宿主保护性免疫反应，清除病毒［1-2］。TLR3主要表达于免疫细胞，也可在上皮细胞及上皮细胞来源的肿瘤细胞中表达，在机体抗感染、炎症反应、肿瘤进展等病理生理过程中发挥重要作用［3-4］。TLR3能识别病毒感染及其复制过程中暴露出来的dsRNA，从而上调细胞因子、趋化因子及抗病毒基因表达，参与抗病毒免疫与病毒清除［5-6］。研究显示，宫颈上皮细胞表达TLR3，TLR3在宫颈HPV感染过程中发挥重要作用。

图4　不同级别宫颈病变中TLR 3与IFN-βDNA相对表达量散点图

3.1TLR3在宫颈 HPV16持续感染中的作用TLR3表达与HPV16清除及其确切作用机制尚不明确，推测可能是通过某些相关信号通路激活免疫细胞，提高机体IFN-β表达水平，从而清除HPV16病毒感染。本研究发现，HPV16持续感染组与非持续感染组相比，TLR3 DNA相对表达量下降，提示TLR3可能在HPV16病毒清除过程中发挥积极作用，TLR3表达水平降低可导致宫颈局部免疫功能异常，从而导致HPV16持续感染。

IFN-β是由单核细胞和淋巴细胞产生的一种细胞因子，具有抗病毒作用，同时还可增强自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞活力，从而发挥免疫调节作用。本研究进一步发现，HPV16持续感染组与非持续感染组相比，IFN-β DNA相对表达量下降，而且TLR3表达水平与IFN-β表达水平呈正相关，提示宫颈TLR3可能通过调节IFN-β途径参与宫颈局部抗HPV免疫反应。

Andersen等［4］通过检测表达HPV16 E6 E7的宫颈管内口、宫颈阴道部及阴道上皮细胞内的TLR3表达量，证实TLR3可能在调节上皮细胞促炎因子和女性下生殖道局部环境抗病毒过程中发挥重要作用。Daud等［7］研究发现，在HPV16随后被清除的宫颈标本中，TLR3表达升高，而在HPV16持续感染的宫颈标本中，TLR3表达无升高。经随访发现，在后来HPV被清除的妇女中，这些TLR3表达量明显高于HPV持续感染的妇女，因此认为，TLR3表达增高对局部病毒清除是必要的。

本研究对HPV16持续感染组与非持续感染组所扩增的TLR3片段进行基因测序，结果未发现该片段基因突变，其原因可能是样本量小或TLR3表达降低的主要机制并非基因突变，而是由于甲基化等表观遗传学改变，这将为TLR3相关研究提供新方向。

3.2TLR3在宫颈病变发生发展过程中的作用本研究发现，HPV16阳性宫颈病变的3组患者TLR3 及IFN-β DNA相对表达量差异有统计学意义，提示TLR3在宫颈病变发生进展中发挥重要作用，其机制可能与下调IFN-β表达有关。Jiang等［8］研究发现，TLR3高表达对肿瘤细胞具有清除作用。其可能机制是宫颈病变可上调TLR3表达，通过激活MyD88非依赖型信号转导通路，诱导产生Ⅰ型干扰素（如IFN-β等）及其他炎性因子，激活相应免疫细胞，从而杀伤病毒感染、转化的细胞；当TLR3表达水平异常或因患者先天因素导致TLR3无法大量表达，以致不能引起足够强的免疫反应，无法有效清除病毒感染和异常细胞，导致宫颈病变进一步进展。

因此，本研究结果认为，TLR3可能通过调控IFN-β表达而调节宫颈局部免疫功能，TLR3表达降低不仅与宫颈HPV16持续性感染有关，而且在宫颈癌前病变及宫颈癌发生及进展中发挥重要作用。但TLR3是否主要通过IFN-β发挥免疫作用，仍需进一步研究。

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Study on the Role of TLR3 in Cervical HPV16 Persistent Infection and Cervical Lesions

TANG Rong-rong，LIU Jia-jia，LIU Rong，ZHANG Li-zhi，LUO Yuan-cai，QU Quan-xin.Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300192，China（TANG Rong-rong，LIU Jia-jia，LIURong，ZHANGLi-zhi，LUOYuan-cai，QUQuan-xin）；TianjinXiqingHospital，Tianjin300380，China（TANGRong-rong）

QU Quan-xin，E-mail：cqjqx@sina.com

2014-12-16）

［本文编辑王琳］

天津市卫生局攻关课题（11KG101）

300192天津市第一中心医院（唐荣荣，刘佳佳，刘荣，张丽志，罗远材，瞿全新）；天津市西青医院（唐荣荣）

瞿全新，E-mail：cqjqx@sina.com