梅毒螺旋体部分膜蛋白研究进展

张素芳 周平玉

梅毒螺旋体部分膜蛋白研究进展

张素芳 周平玉

梅毒是由梅毒苍白螺旋体引起的一种可侵犯多器官的慢性性传播疾病。目前梅毒螺旋体尚不能在体外长期培养，获取较困难，从而阻碍了对梅毒致病机制的研究、诊疗方案的优化和疫苗的研制。梅毒螺旋体全基因序列的揭示，TprK蛋白、Tp0483蛋白、Tp0155蛋白等一些重要膜蛋白成功表达及对其结构特点、抗原性和免疫保护作用的深入研究，为梅毒发病机制的研究、诊疗方案的优化和疫苗的研制提供了基础和可能。概述近年来新发现的对梅毒螺旋体具有诊断意义和免疫保护作用的几种主要膜蛋白的研究状况。

梅毒；苍白密螺旋体；外膜蛋白质类；疫苗；免疫；抗原变异

近年来梅毒的发病率呈快速上升趋势，对公共卫生构成严峻挑战。梅毒是由梅毒苍白螺旋体（Tp）引起的一种慢性播散的性传播疾病，可侵犯全身各器官，产生多种临床症状和体征，导致多系统病变和出现不可逆性损害，危害极大。虽然青霉素对治疗梅毒有特效性，但仍不能有效控制病原体传播。迄今梅毒螺旋体尚不能在体外长期培养，并且人类是Tp的唯一自然宿主，梅毒家兔模型不能完全模拟人的发病，这些都阻碍了对梅毒发病机制的研究和疫苗研制的进程。随着分子生物学技术的发展，梅毒螺旋体基因组测序完成后，人们陆续发现了一系列与梅毒螺旋体致病及免疫应答等相关的重组Tp膜蛋白。有学者研究发现，TprK基因具有异质性，从而引起Tp抗原变异性［1-3］。Tp0483和Tp0155蛋白与宿主细胞基质结合，在Tp早期感染起重要作用［4］。这些膜蛋白有望成为提高优化梅毒诊疗方法和疫苗研制的候选抗原，以期用于降低梅毒发病率和优化临床治疗方案。

1 Tp0326

1.1 Tp0326基因和氨基酸序列特点：2000年Cameron 等［5］发现 Tp0326，其全长 2 562 bp，编码853个氨基酸，相对分子质量为96 127。Tp0326蛋白为与革兰阴性杆菌序列同源的外膜蛋白，归类为孔蛋白家族，其预测结构模型是N末端包含5个多肽运输相关结构域（POTRA），C末端由18股两亲性β桶状结构组成［6］。β桶状结构外膜蛋白是革兰阴性细菌细胞外膜层的主要组成部分，在营养吸收、维持外膜完整性、病原菌致病性及多重耐药性等方面发挥作用。Desrosiers等［7］采用定量免疫印迹方法测Tp每个细胞Tp0326基因的表达，发现Tp0326转录极少。用蛋白酶K处理新鲜萃取的Tp并联合免疫印迹方法，蛋白酶K为10 μg/ml时，Tp0326蛋白开始出现降解，而对照组中Tp0453和Tp0163蛋白没有降解。当先用具有溶解脂质作用的聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和能使组成菌体细胞膜的多糖物质分解的溶菌素处理新鲜萃取的Tp，破坏Tp的外膜，Tp0326蛋白、Tp0453和Tp0163蛋白没有降解，再加同量蛋白酶K，它们均出现降解。从而确定Tp0326蛋白为Tp外膜蛋白，进一步证实Tp0453和Tp0163蛋白是周质蛋白。

1.2 Tp0326蛋白的免疫原性和免疫保护：虽然Tp0326蛋白表达极少，且具有易碎性，但Tp0326蛋白能引起较强的免疫应答。有研究发现，Tp0326蛋白的POTRA蛋白重组体和β桶状结构蛋白重组体均与Tp感染兔模型的血清产生较强的抗体反应，而与二期梅毒患者血清反应的主要为POTRA［7］。表明二期梅毒患者体内缺乏与β桶状结构蛋白重组体反应的抗体，推测Tp的β桶状结构可能参与Tp在机体内的免疫逃逸。在免疫保护方面，Cameron等［5］用rTp92（即rTp0326）蛋白免疫实验兔之后，再选8个部位皮内注射105个Tp（重复3次或5次），以未免疫兔做同样处理作为对照组。未免疫兔出现典型的凸起，较硬红色皮损，大部分发展成溃疡，而免疫兔皮损表现为苍白，平坦，稍硬，很少发展成溃疡。由此表明，rTp92蛋白有部分免疫保护作用。此外，Tp92还促进巨噬细胞调理作用，提高巨噬细胞吞噬，溶解Tp的能力。因此，Tp92作为一个调理素抗体的靶点和能产生免疫保护作用的抗原，有望成为制作梅毒免疫疫苗的候选膜蛋白之一。

2 Tp0136

2.1 Tp0136基因和氨基酸序列特点：Tp0136全长1 488 bp，编码495个氨基酸，相对分子质量为50 123。成熟Tp0136蛋白的第2个氨基酸为天冬氨酸，这与其他革兰阴性杆菌膜蛋白的结构类似，但膜蛋白位置不同。有研究发现，大肠杆菌内脂蛋白N端的第2氨基酸为天冬氨酸时，该脂蛋白位于内膜蛋白，似乎若第2个氨基酸为其他氨基酸时，将使该脂蛋白位于外膜蛋白［8］。也有研究认为，梅毒螺旋体杆菌脂蛋白在内膜或外膜的位置与第2个氨基酸无关联性。Cullen等［9］推测，在螺旋体杆菌中脂蛋白的构象比氨基酸排列顺序更能直接影响脂蛋白的位置。Tp0136蛋白位于梅毒螺旋体的外膜上［8］。另外，Tp0136氨基酸序列中含有多个甘氨酸和丝氨酸重复序列。同样，在真核生物恶性疟原虫的基因组中也发现含有这样的同源重复的氨基酸序列，其中一些片段具有较高的抗原性。因而推测，Tp0136蛋白序列中的这些丝氨酸、甘氨酸重复序列可能是该蛋白免疫原性的关键区域。

Tp0136基因的开放读码框在Tp各亚种和菌株之间均存在不同程度的变异［10-12］。Brinkman 等［8］对Street Strain 14、Samoa D、Samoa F和 CuniculiA 等 4个不同菌株的Tp0136基因进行PCR扩增和DNA测序后发现：与Nichols标准株中的Tp0136序列相比，不同菌株之间的Tp0136出现基因错配、插入和缺失，这些突变导致了预测的Tp0136氨基酸同系物不同。Tp0136基因在Tp各亚株之间的异质性和序列变异可能是Tp发生免疫逃逸机制之一。

2.2 Tp0136蛋白的免疫原性和免疫保护作用：Tp0136蛋白能特异地黏附在宿主细胞上，这在Tp感染宿主的第一步中起作用。Brinkman等［8］用rTp0136蛋白作为探针，检测多种可能是Tp黏附的细胞外基质（包括血清纤连蛋白、超纤连蛋白、层黏连蛋白、胶原蛋白IV等），结果显示，rTp0136蛋白与纤连蛋白、层粘连蛋白、超纤连蛋白发生黏附反应且有统计学意义，而对照组（以不相关蛋白为探针）反应较弱。在Tp0136蛋白的免疫原性方面，用rTp0136蛋白感染实验兔模型14 d后兔血清中即出现rTp0136抗体，在感染90 d后抗体浓度开始轻微下降，这些研究提示rTp0136抗体对早期诊断Tp感染有重要价值。在免疫保护方面，rTp0136抗体能延迟皮损出现的时间，减轻皮损的损害，但不能阻止Tp感染。另外，用rTp0136蛋白为包被抗原的间接ELISA方法检测一期梅毒、二期梅毒和早期潜伏梅毒患者血清中抗rTp0136抗体，同时对照组以不相关蛋白为包被抗原，发现与对照组相比rTp0136实验组免疫反应很强，表明rTp0136蛋白能在感染宿主内引起较强的特异性抗体免疫应答。rTp0136蛋白有望成为早期诊断Tp感染和研制梅毒疫苗的候选抗原之一。

3 Tp0453

3.1 Tp0453基因和氨基酸序列特点：Tp0453基因全长864 bp，编码287个氨基酸，相对分子质量为31 979。Tp0453蛋白是一个具有两亲性的整合外膜蛋白，预测包含 5 个 α 螺旋［13］。Luthra 等［14］研究发现，TP0453结构为球形，在高浓度的非离子洗洁剂存在时由闭合状态转为开放，从而暴露大量疏水基团，用铽-吡啶二羧酸配合物负载大单层囊泡（terbium-dipicolinic acid complex-loaded large unilamellar vesicles）法证实在酸性条件下，该蛋白具有增强荧光团流出的能力。还验证了TP0453含多种α螺旋，但是仅有相邻的两个α螺旋对膜整合有重要作用。革兰阴性细菌的外膜蛋白含有大量β折叠结构参与营养物质的运输。然而，Hazlett等［13］发现，Tp0453缺乏β折叠结构，含有多种穿膜的两亲性α螺旋结构，在此基础上推测，TP0453存在于嵌入外膜蛋白和未嵌入形式的动态平衡中，α螺旋在插入外膜蛋白瞬间促进水溶性营养物质进入，可能为TP0453在Tp摄取营养物质机制之一。此外，Tp0453形成一个稳定的二聚体嵌入膜内，这个结构特点和结核分枝杆菌的脂蛋白相似［15-16］，推测TP0453蛋白在TP外膜蛋白可能充作运载脂质，糖脂等功能。

3.2 Tp0453蛋白的免疫原性和免疫保护作用：Van Voorhis等［17］分别用重组 Tp0453、Tp92 蛋白包为被抗原，ELISA法检测一期、二期梅毒及早期潜伏梅毒患者血清抗体，从而发现，rTp0453与各期梅毒患者（共43例）血清均发生免疫反应。以同样方法检测钩端螺旋体病（9例）、回归热（8例）、莱姆病（8例）患者血清，rTp0453与全部患者血清无免疫反应，因此，rTp0453的灵敏度和特异度均比较高。此外，Tp0453能与性病研究实验室试验阴性的早期梅毒患者血清发生免疫反应。Tp0453能与性病研究实验室实验阴性的早期梅毒患者血清发生免疫反应，对早期梅毒具有诊断意义。

Smith等［18］通过 pET28a表达载体转载氨基酸序列A32-S287至大肠杆菌内产生可溶性rTp0453蛋白，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析法检测其纯度＞98%。以可溶性rTp0453为包被抗原，用ELIAS法检测169例各期梅毒患者血清，其灵敏性为98%。同法检测21例假阳性和38例交叉反应感染者（钩端螺旋体，伯氏疏螺旋体，幽门螺旋杆菌等）血清，可溶rTp0453蛋白均无免疫反应，其特异性100%。这些研究表明，Tp0453作为梅毒特异性诊断候选抗原检测各期梅毒更具有精确性，可降低误诊率，对早期隐性梅毒血清学诊断具有重要意义。

4 Tp1038（TpF1）

4.1 Tp1038基因和氨基酸序列特点：Tp1038基因全长534 bp，编码177个氨基酸，相对分子质量19 361。TpF1蛋白是一个由二硫键连接的12个相同单元体形成环状稳定的寡聚蛋白质，归类为DNA结合蛋白家族，其功能是螯合铁离子，保护DNA免受氧化性损伤，具有氧化铁酶作用［19］。

4.2 Tp1038蛋白的免疫原性和免疫调节：Jiang等［20］用pET28a-TpF1原核表达载体，在E.coliBL21中表达出重组蛋白TpF1，rTpF1免疫兔能诱导产生高效价的特异性抗体，表明重组蛋白TpF1具有较强的免疫原性。用rTpF1作为包被抗原间接法ELISA检测各期梅毒血清，敏感性和特异性分别为98%和100%，而且与8例快速血浆反应素环状卡片试验阴性的梅毒患者血清发生免疫反应。因此，重组蛋白TpF1有望成为用以筛查梅毒的商业化酶联免疫吸附测定候选抗原之一。

在免疫调节方面，rTpF1既能诱导炎症反应，也能间接促进抗炎的调节性T细胞分化［21］。rTpF1刺激单核细胞合成和释放肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β等炎症因子，有利于对Tp清除。同时，rTpF1又能刺激单核细胞释放IL-10和转化生长因子β，这两种细胞因子促进调节性T细胞分化，从而促进调节性T细胞的反应。这可能是Tp发生免疫逃逸长期感染机体的机制之一。

5 结语

Tp的重组膜蛋白具有低表达，易碎性。虽然分子生物学技术的发展较快，但是这些技术对Tp膜蛋白检测的灵敏性不高。因此，提取完整膜蛋白较困难，限制了对外膜蛋白的研究。然而，通过对这些膜蛋白的深入研究，Tp蛋白结构功能日益明确，选取具有较好免疫保护作用和免疫原性的Tp膜蛋白可作为梅毒诊断方法和研制Tp疫苗的备选抗原，为Tp的致病机制、诊断方法和疫苗研究带来新的契机。

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提高梅毒检测准确性 辅助指导临床实践

在东方检验年会期间举行的“罗氏诊断卫星会——新一代Elecsys®Syphilis梅毒免疫检测试剂中国多中心研究分享学术会议”上，南京医科大学第一附属医院潘世扬教授和复旦大学附属中山医院潘柏申教授分享了新一代Elecsys®Syphilis梅毒免疫检测性能比对中国多中心研究进展，并深入讨论Elecsys®Syphilis梅毒免疫检测在中国人群的循证依据，旨在辅助指导临床实践，提高患者生存质量。潘柏申教授指出：“尽早进行梅毒筛查，及时发现并切断梅毒传染源非常重要，尤其要加强HIV患者、男男性行为者、静脉注射吸毒者、性工作者及相关孕妇等高危人群的筛查。”早期诊断、及早治疗和预防、可有效降低梅毒长期并发症的风险，降低死胎和先天性梅毒风险以及传播风险，极大减轻梅毒带来的家庭、社会和国家负担。

由于大多数梅毒感染者早期无症状，血清学检测是主要的实验室梅毒检测方法，包括非梅毒螺旋体抗原试验和梅毒螺旋体抗原试验。国际上，许多实验室已使用自动化梅毒螺旋体抗原试验进行大样本量的筛查，用非梅毒螺旋体抗原血清试验做确认。作为梅毒螺旋体抗原反向检测的新成员与有力补充，Elecsys®Syphilis梅毒免疫检测已于2014年8月正式在中国获批上市，通过检测梅毒螺旋体总抗体，在常规临床筛查中发现梅毒患者，并有效检测出不同分期的梅毒感染。为在自然条件下比较Elecsys®Syphilis梅毒检测试剂与已上市的其他方法学梅毒检测试剂的灵敏度与特异性，四川大学华西医院联合全国16家医院共同开展了“罗氏诊断新一代Elecsys®Syphilis梅毒免疫检测试剂性能比对多中心研究”。中期研究结果显示，Elecsys®Syphilis梅毒检测试剂具有优良的灵敏度和特异度，其完整的最终数据会带来更有力的循证医学证据。由多个国家参与的CE认证（欧盟统一认证标准）研究、批间比较研究以及EAP（Expedited Access Pathway，美国FDA快速通道项目研究）上市后研究也对Elecsys®Syphilis梅毒检测试剂的性能进行了多中心评估。潘世扬教授指出：“对2 832份样本进行筛查发现，其阴性结果与阳性结果之间具有明确的截断值（cut-off），无灰区，可帮助临床迅速决策，减少重复检测次数，使结果解读更为明确。”

Progress in some membrane proteins ofTreponema pallidum

Zhang Sufang*,Zhou Pingyu.*Shanghai Skin Disease Clinical College,Anhui Medical University,Shanghai 200050,China

Syphilis,a chronic sexually transmitted disease caused byTreponema pallidum （Tp）,can affect multiple organs.At present,Tp can not been culturedin vitrofor a long time and is difficult to obtain,which has hampered the exploration into the pathogenesis of syphilis,optimization of syphilis diagnosis and treatment,and development of syphilis vaccines.The identification of complete genome sequence of Tp,successful expressions of some important membrane proteins such as TprK,Tp0483 and Tp0155,and in-depth study of the structural characteristics,antigenicity and immunoprotective effect of these membrane proteins have provided the basis for and possibility of investigating into the pathogenesis of,optimizing the diagnosis and treatment of,and developing vaccines for,syphilis.The authors summarize recent advances in some major membrane proteins of Tp with diagnostic value and immunoprotective effect.

Syphilis;Treponema pallidum;Outer membrane proteins;Vaccines;Immunity;Antigenic variation

Zhou Pingyu,Email:zpyls@yahoo.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.03.019

国家自然科学基金（81371862）

200050上海，安徽医科大学上海市皮肤病临床学院（张素芳）；上海市皮肤病医院性病科（周平玉）

周平玉，Email:zpyls@yahoo.com

2014-05-27）