微生物遗传多样性的挖掘和代谢工程应用

赵心清， 陈洪奇， 许建韧

(1.大连理工大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116023；2.上海交通大学 生命科学技术学院，上海 200240；3.上海交通大学 微生物代谢国家重点实验室，上海 200240)



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微生物遗传多样性的挖掘和代谢工程应用

赵心清1,2，3， 陈洪奇1， 许建韧1

(1.大连理工大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116023；2.上海交通大学 生命科学技术学院，上海 200240；3.上海交通大学 微生物代谢国家重点实验室，上海 200240)

随着近年来系统生物学研究的深入，微生物的基因组、转录组、蛋白组及代谢组等不同层次的组学信息不断增加。我国具有丰富的微生物多样性，但目前对多样性的研究大多集中在物种多样性及生态多样性方面，对微生物菌株水平遗传多样性的研究还刚刚起步。以酿酒酵母和链霉菌为例，结合本课题组的成果，总结了近年来利用其基因组序列及转录组蛋白质等功能基因组信息，开发利用其遗传多样性的研究进展。在工业酿酒酵母中发现了多个独特的功能基因，包括絮凝基因及与环境胁迫耐性相关的调节蛋白基因，还发现了独特的启动子序列。此外，在海洋放线菌基因组中也发现了独特的调节基因。对微生物遗传多样性的挖掘利用，不仅有助于深入理解微生物不同菌株中独特的调节方式，也为微生物的代谢工程改造提供了大量新的可利用的遗传组件。

酿酒酵母；海洋放线菌；胁迫耐受性；遗传多样性；调节蛋白

微生物的物种多样性一直是很多研究者关注的课题。我国幅员辽阔，生态环境多样，微生物也具有丰富的多样性，很多学者一直致力于微生物新种的研究，近年来不断发现很多新的属种甚至新的科的菌种，这些研究不仅丰富了我们对不同自然生态环境条件下物种适应机制的认识，也为进一步开发利用这些宝贵的微生物资源奠定了基础。但是，同种微生物不同菌株间也存在很大的差异性，用于生产实践的良好菌株是提高生产效率的重要前提和保证。微生物的性状同时受遗传控制和环境影响，对微生物遗传多样性的研究，有助于进一步定向控制微生物的性状，尤其是工业微生物的生产性状。已知同种微生物不同菌株间可能存在较大的性状差异，然而目前对于工业生产环境条件下以及从不同自然环境中分离的微生物不同菌株的遗传多样性研究还很少。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和链霉菌(Streptomycessp.)是2种非常重要的工业微生物，其中酿酒酵母广泛应用于食品、酿造和生物燃料生产中，也是生命科学研究中比较重要的模式真核生物；链霉菌是生产抗生素的重要放线菌之一，所产生的很多次生代谢物均具有医疗和农业生产的应用潜力。随着海量的多组学数据的不断涌现，目前微生物的研究已经由菌种研究时代扩展到菌株研究时代，不断增多的研究结果表明，微生物存在菌株水平的丰富多样性。本文对酿酒酵母和链霉菌的遗传多样性研究进行了综述，结合本课题组的相关研究结果，对酿酒酵母的基因水平多样性、启动子序列多样性进行了阐述，并对微生物遗传多样性开发利用的前景进行展望。

1 酿酒酵母遗传多样性研究

1.1 酿酒酵母自然遗传多样性研究

酿酒酵母是燃料乙醇的主要生产菌，对其不同菌株的差异性研究有很多报道。我们近期的研究表明，在构建木糖共发酵重组酵母时，将同样的木糖代谢途径基因整合到不同工业酿酒酵母宿主中得到的菌株木糖共代谢的水平有明显差别[1]，类似的研究结果国外学者也有报道[2-3]，表明宿主的遗传背景对工业酿酒酵母的应用具有显著影响。

中科院微生物研究所的研究人员对国内不同生态环境和地理来源的数千株酿酒酵母进行了分离和菌株多样性分析，发现我国的酿酒酵母具有极大的遗传多样性，几乎达到其他国家和地区遗传多样性总和的2倍[4]。研究者对99株具有代表性的菌株进行了深入研究，结果表明，S.cerevisiae不同菌株存在明显的种群分化；其中野生菌株中存在8个独立的演化谱系，来自原始森林的谱系存在显著的遗传分化，而来自工业应用的谱系群体分化程度相对较低，可能与相对稳定的生产环境对菌株的选择有关。这一研究中遗传多样性分析采用的是9个常用于系统发育分析的基因和4个基因间隔区，这9个基因包括CCA1、CYT1、DSN1、LAS1、MET4、MLS1、NUP116、PDR10和ZDS2，目前对工业应用相关基因的多样性情况尚不清楚。比如，工业酿酒酵母在生产过程中受到多种环境胁迫因素的影响[5]，这些胁迫因素包括高温、低pH、毒性浓度的乙醇以及纤维素乙醇生产过程中水解液中存在的乙酸等抑制物，而影响这些耐受性的基因很多[6]，因此，对不同自然生境来源的酿酒酵母进行深入的分析，也许能找到更适合工业应用的酿酒酵母宿主。

近几年的研究表明，酿酒酵母不同菌株间存在着丰富的遗传多样性。絮凝是酿酒酵母的一个重要生产性状，由负责糖蛋白合成的絮凝基因编码，这些絮凝基因包括FLO1、FLO5、FLO9、FLO10等[7]。我们在不同的酿酒酵母菌株中克隆出了多种絮凝基因[8]，絮凝基因的长度不同，拷贝数也不同。在絮凝酵母SPSC01中克隆得到了目前为止报道的最长的絮凝基因，全长达8 kb以上，比模式酵母的FLO1絮凝基因(4.6 kb)长了近1倍[9]。此外，我们还从絮凝酵母中发现了独特的转录调节基因，该基因与模式酵母的等位基因相比含有2个氨基酸突变，深入研究表明，只有当这2个氨基酸同时突变时，才能获得提高耐温性的表型，说明这2个氨基酸残基对控制耐温性具有重要的作用(专利申请中)。酿酒酵母对不同环境胁迫的耐受性是非常重要的性状。我们的研究表明，不同酿酒酵母菌株中存在多样的耐性相关基因，可以用来进行高活性酿酒酵母菌株的改造。

除了结构基因的多样性，我们还发现启动子区域也具有多样性。我们在絮凝酵母SPSC01中克隆得到了独特的海藻糖合成酶启动子PTPS1-SPSC，与模式酵母S288c的海藻糖合成酶启动子PTPS1-S288c相比，该启动子多了一个胁迫响应元件(Stress-Responsive Element, STRE)[10]。有报道表明，这种胁迫响应元件可被胁迫响应相关的转录因子识别，并继而受到转录水平的调控[11]。比较2种启动子启动絮凝基因的研究表明，来自工业酵母的PTPS1-SPSC具有更强的启动细胞絮凝的活性(未发表结果)。启动子对功能基因的表达和代谢性能影响很大[12]，我们的研究结果表明，不同的工业菌株中可存在多种不同活性的启动子，可用来作为代谢工程改造的遗传元件。

1.2 酿酒酵母人工多样性研究

除了自然界存在的微生物菌株水平的自然多样性(Natural diversity)，在实验室通过进化工程(Evolutionary Engineering)、基因组改组(Genome shuffling)、全局转录机制工程(Global Transcription Machinery Engineering, gTME)及随机诱变等[13-16]，还可产生人工多样性(Artificial diversity)，并通过对得到的多样性进行深入分析，获得关于基因功能和调控机制的深入认识[9-10]。此外，在此基础上，还可以利用合成生物学技术定向设计遗传组件，构建性能增强的酿酒酵母[17]。

人工转录因子是人工设计的非天然调控蛋白，其中人工锌指蛋白研究较多。目前对人工转录因子的调控机制还不清楚，可以推测，人工转录因子在细胞中可建立不同于天然调控网络的人工调控网络，进一步对该人工调控网络进行分析，可获得在基因表达调控水平的多样性信息。利用人工锌指蛋白的质粒文库，我们获得了耐乙醇性能提高的工业酿酒酵母突变体。进一步分析人工锌指蛋白的可能结合序列，发现十几个基因可能参与环境胁迫耐性的调控。对其中几个可能基因进行实时定量PCR分析，发现3个基因在乙酸耐性提高的突变体中表达下调。进一步对这3个基因进行敲除，发现QDR3的敲除突变体乙酸耐性明显提高[18]。类似研究将有助于发现不同于天然调控水平新的遗传多样性。

1.3 利用组学信息挖掘酿酒酵母的遗传多样性

酿酒酵母基因组编码信息提供了功能的可能性，而转录组、蛋白组和代谢组信息则提供了酿酒酵母功能多样性的信息。我们对絮凝酵母的蛋白组分析结果进行了深入研究，发现液泡蛋白酶B(Prb1p)在连续乙醇发酵条件下，在细胞活性较好的实验组中蛋白表达水平上调(未发表结果)。对该蛋白酶的编码基因PRB1进行了过表达，发现获得的突变体酵母具有良好的耐温性[19]。液泡蛋白酶B参与多种糖酵解酶的降解[20]；此外，该蛋白也参与其自身及其他蛋白水解酶的成熟[21]。对错误折叠或失去功能的酶进行降解[22-23]，可保证细胞的活性和细胞行使正常功能，并进一步促进氮元素的循环利用。但目前对于这个蛋白酶基因对酿酒酵母环境胁迫耐受性的研究还非常有限。我们的研究表明，通过对酿酒酵母培养条件的扰动，结合转录组学和蛋白组学等多组学分析，可深入揭示酿酒酵母的新功能基因，并进一步研究其调控机制在不同菌株中的多样性调控。利用代谢组分析，我们还发现氨基酸代谢对胁迫耐性的重要作用[19]，对多种酿酒酵母代谢调控的比较研究，将揭示更多水平的功能多样性和遗传多样性。

2 链霉菌遗传多样性研究

2.1 链霉菌基因组挖掘(Genome mining)

链霉菌(Streptomycessp.)是多种抗生素的生产菌，是重要的工业微生物之一。近年来，大量的链霉菌基因组信息被获得，如何利用这些基因组信息成为研究者关注的课题。基因组挖掘利用基因组信息，分析可能存在的生物合成基因簇和生物合成酶的信息，并在此基础上推断可能合成的化合物的分子量、紫外吸收、关键官能团等信息，从而指导新化合物的发现，或者通过对新酶的研究获得新的催化功能的信息[25]。随着海量链霉菌基因组序列的公开，对链霉菌这种重要的微生物进行基因组挖掘已经成为国内外研究的热点。

2.2 链霉菌遗传多样性的利用

链霉菌基因组中具有所有链霉菌都具有的基因，也有很多是菌种特异性的基因，对这些基因进行深入研究，可发现新的遗传组件用于菌株的代谢工程改造。本课题组从大连地区海泥样品中分离鉴定了2个海洋链霉菌新种，分别命名为星海链霉菌(S.xinghaiensis)[26]和小平岛链霉菌(S.xiaopingdaonensis)[27]。此外，我们还对其基因组进行了测序[28-29]，发现其基因组存在很多未知功能的基因和抗生素生物合成基因簇。这些信息为深入研究链霉菌的遗传多样性提供了丰富的信息。

目前对链霉菌的基因组挖掘多关注次生代谢物生物合成基因簇的分析和激活，以及新化合物的发现，对链霉菌的调节蛋白的关注还不多。我们从星海链霉菌基因组中发现了很多新的次生代谢生物合成酶基因和调节基因，其中StreptomycesAntibiotic Regulatory Protein (SARP)家族蛋白基因是研究较多的调控抗生素生物合成的调节基因，很多作为途径特异性转录激活蛋白被发现，即这些调节蛋白可以特异性地激活所在基因簇的生物合成酶的转录。我们在本课题组鉴定的海洋链霉菌新种星海链霉菌基因组中发现了一个SARP家族蛋白Sc5140，并探讨了其对1株工业链霉菌菌株Streptomycessp. KCCM 11116P免疫抑制剂他克莫司(FK506)生物合成的调控作用。结果表明，Sc5140的过表达可促进他克莫司早期生物合成的效率，这是首次利用异源的调节蛋白调控抗生素的生物合成[30]，说明在微生物中存在大量的遗传调控元件，可以用来进行不同微生物菌株的代谢工程改造，提高抗生素的产量。

3 结论和展望

微生物在自然界广泛分布，具有丰富的物种多样性。随着对微生物研究的不断深入，目前对微生物菌株水平的多样性研究揭示了微生物存在结构基因多样性和遗传调控机制的多样性。对微生物进行合成生物学研究也需要考虑到微生物不同菌株的遗传多样性，而这种多样性也对合成生物学标准化设计提出了挑战。酿酒酵母等工业微生物在长期使用过程中，形成了多样的适应机制，但同时重要的调控机制也有共同点。对微生物菌株的自然遗传多样性和人工遗传多样性进行深入研究，将揭示更多的独特的遗传信息和遗传调控方式，并为微生物的代谢工程改造提供更多可使用的工具。

致谢 感谢大连理工大学白凤武教授及其课题组全体师生的支持和帮助。

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Exploration of the genetic diversity of microbial strains for metabolic engineering

ZHAO Xin-qing1,2,3, CHEN Hong-qi1, XU Jian-ren1

(1.SchoolofLifeScienceandBiotechnology,DalianUniversityofTechnology,Dalian116023,Liaoning,China; 2.SchoolofLifeScienceandBiotechnology,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240; 3.KeyLaboratoryofMicrobialMetabolism,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240)

With the in-depth studies of systems bology, multi-omics (genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics) data is increasingly emerging. It has been well studied and accepted that there is a vast diversity of microorganisms in China, however, so far most studies focus on the species diversity and its ecological implication, there is still few studies focusing on the genetic diversity of microorganisms. In this review, brewing yeast strains ofSaccharomycescerevisiaeand streptomycetes were used as examples, and research progress in the exploration of the genetic diversity of genes responsible for yeast flocculation and stress tolerance, as well as special promoter sequence in industrial yeast strains was summarized. In addition, the effect of regulatory protein identified from marine actinobacteria on heterologous antibiotic production was also presented. Exploration and utilization of the genetic diversity of microorganisms provides basis for not only the understanding of specific regulatory mode in different strains of microorganisms, but also the metabolic engineering of microorganisms using diverse genetic elements.

Saccharomycescerevisiae; marine actinobacteria; stress tolerance; genetic diversity; regulatory proteins

赵心清，女，上海交通大学生命科学技术学院教授、博士生导师，辽宁省微生物学会常务理事，国际期刊BiotechnologyAdvances编委。1993年在东北师范大学生命科学院获学士学位，1996年在东北师范大学遗传与细胞研究所获得理学硕士学位，1998年3月至2014年9月在大连理工大学工作，其间2002年至2005年底在韩国明知大学微生物实验室工作，2006年初获博士学位，2007年至2009年获得德国洪堡基金会资助，在Tuebingen大学药学院进行博士后研究工作，2014年10月起工作于上海交通大学生命科学技术学院。主要从事工业微生物代谢工程改造及生物质转化等研究；重点研究酿酒酵母的代谢工程改造，并应用于生物燃料生产。已在BiotechnologyandBioengineering,MetabolicEngineering等国际上有影响的杂志发表多篇论文，获得多项国家发明专利。主持国家自然科学基金及国家863项目等多项科研课题，2011年获得教育部新世纪优秀人才项目资助。

国家高技术研究发展计划 (863计划)项目 (2012AA021205，2012AA101805)；教育部新世纪优秀人才支持

赵心清 女，教授，博士生导师。主要从事工业微生物代谢工程改造及生物质转化等研究。E-mail: xqzhao@dlut.edu.cn

2015-02-10

Q93

A

1005-7021(2015)01-0001-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.001

计划项目(NCET-11-0057)