细菌挥发性代谢产物的类型、检测技术及应用

陈 娟， 史 辉， 王 琼， 唐俊妮

(西南民族大学 生命科学与技术学院，四川 成都 610041)



细菌挥发性代谢产物的类型、检测技术及应用

陈 娟， 史 辉， 王 琼， 唐俊妮*

(西南民族大学 生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

细菌挥发性代谢产物是细菌代谢产物的重要组成部分，与细菌生命活动和细菌生长数量密切关联，是细菌与周围各种生物进行交流的重要信息物质。细菌挥发性代谢产物类型和特征表现复杂，其浓度低、种类多，从极性到非极性跨度大，需要依赖特殊检测技术进行分析测定。归纳了常见细菌挥发性代谢产物的类型，介绍了气相色谱-质谱和电子鼻两种检测挥发性有机化合物的方法，例举了细菌挥发性代谢产物检测在医学和食品科学研究领域的应用，并提出了细菌挥发性代谢产物检测研究中的几个关键问题。

细菌挥发性代谢产物；类型；检测

细菌能够利用周围环境中的糖类、蛋白质和脂肪等营养成分，在不同酶的作用下生成葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等。这些物质一方面进行同化作用，合成细菌的结构成分，另一方面则通过异化作用产生能量，同时生成一系列复杂的代谢产物，其中就包括醇类、醛类、酸类、酯类和酮类等细菌挥发性有机化合物(bacterial volatile metabolites, BVMs)。相比其他生物如植物和真菌释放的挥发性有机成分而言，BVMs具有更加复杂的特征，成为新天然成分的重要来源。BVMs是发散出的气体，因此能够被直接且快速地检测到，为许多领域提供了一种理想的检测手段。分析BVMs的方法主要有气相色谱-质谱、电子鼻、质子转移反应质谱和选择离子流动管质谱等技术。本文针对BVMs的类型、检测技术及其应用和存在的问题等方面进行了综述。

1 细菌挥发性代谢产物的类型

很早以前，微生物学家就已经认识到细菌能释放特征性的挥发性产物。许多气味早已被人们所熟知，并被视作干酪、泡菜、酸乳酪和酒类等发酵食品的香气成分。另外，许多腐败有机质的不良气味也由细菌释放。许多研究揭示了细菌具有产生大量挥发性物质的强大能力[1-3]。例如，链霉菌就能产生多达80种不同的挥发性成分[4]。近年来，随着分析测试技术的不断发展，对微生物挥发性物质的定性和定量分析已取得了很大进展。Schulz和Dickschat经过巨大努力和对公开数据的严格评判，总结了迄今为止所有已知的细菌挥发性成分：各种细菌共释放346种可检测成分，包括75种脂肪酸衍生物、50种芳香族化合物、74种含氮化合物、30种含硫化合物、96种萜类化合物和18种卤代物、硒、碲和其他非金属化合物[2]。但是，大多数的挥发性成分还不能通过NIST-GC-MS谱库或其他谱库被准确确认，其结构仍然有待进一步被阐明。表1归纳了常见细菌挥发性代谢成分的类型，一些化合物广泛存在于各类细菌释放物中。尽管某些种或属的细菌被发现存在着交迭的挥发性代谢产物类型，但每个种或属的细菌都有着独特的代谢方式，典型的挥发性成分和挥发性特征必定是种或属所特有的，可以视为鉴别的生物标志。目前，细菌挥发性成分已被汇编入公共数据库http://bioinformatics.charite.de/mvoc[5]。

表1 常见细菌挥发性代谢产物(BVMs)的类型

续表1

注：SA:Staphylococcusaureus(金黄色葡萄球菌)； SP:Streptococcuspneumoniae(肺炎链球菌)； EF:Enterococcusfaecalis(粪肠球菌)；PA:Pseudomonasaeruginosa(绿脓杆菌或铜绿假单胞菌)； KP:Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯菌或克雷白氏杆菌)； EC:Escherichiacoli(大肠埃希菌)； MAP:Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis(鸟分枝杆菌副结核亚种)；Pseudomonas: 假单胞菌属；Shewanella: 希瓦氏菌属；Enterobacter: 肠杆菌属；Klebsiella: 克雷伯菌属；Staphylococcus: 葡萄球菌属；Streptomyces: 链霉菌属；Bacillus: 芽胞杆菌属

2 细菌挥发性代谢产物的检测技术

分析BVMs的方法目前主要有气相色谱-质谱、电子鼻、质子转移反应质谱、选择离子流动管质谱和气相色谱-嗅觉测量法等，但以气相色谱-质谱技术和电子鼻技术最常用。气相色谱-质谱技术(Gas chromatography-Mass spectrum)集成了分离和检测程序，能获得细菌挥发性有机化合物的具体分析结果。电子鼻技术(Electronic nose)主要反映细菌挥发性有机化合物的整体特征。

2.1 气相色谱-质谱技术

气相色谱是一种优异的分离技术，能出色的分离复杂混合物，尤其适合于低极性热稳定物质的分析。离子化质谱是一种能产生带电荷的分子碎片并获得其质荷比的方式，有机小分子物质经离子化后形成复杂的具有重复性的质荷比类型，可以表征母体分子的化学结构，具有高灵敏度和高选择性的优点[17]。气相色谱与离子化质谱的有机结合是一种分析挥发性化合物的传统且经典的技术，在生物化学、医学、农业和环境等研究领域被广泛应用。然而，气相色谱-质谱获得的实验数据有时存在无规律性且不理想，在数据处理与分析时，如何从共流出图谱中提取纯物质以及如何准确定量化合物的强度是面临的困难。目前，AMDIS是一种被广泛采用和公开讨论的色谱峰解卷积方式，能在一定程度上解决这些难题[18]。另外，多维气相色谱的发展大大改善了复杂细菌挥发性化合物的分离效果，使得从相应挥发性特征提取潜在生物信息变得更加容易[19]。

2.2 电子鼻技术

除了经典的化学分析方法以外，基于仿生学和电子学原理形成的电子鼻技术也成为了一种分析生物挥发性化合物的新方法。电子鼻是以一系列非特异性的气敏性化学传感器作为人造气体感应器，感应器的类型包括金属氧化物、半导体聚合物、导体电活化聚合物、表面声波和电化学气体传感器等。完整的电子鼻系统是由复合传感器阵列、信息处理单元、类型辨识运算软件和参考图谱库几大要素构成[20]。作为一种生物鼻的电子模拟系统，电子鼻在近几年内已经广泛应用于各种生物样品挥发性特征的分析[21]。对于样品的分析，电子鼻是以“香气类型”而不是“化学类型”作为输出结果，也就是说电子鼻能对整体的生物挥发性特征作出响应，但却不能对每一个单独的挥发性成分作出响应。目前，电子鼻仅用于辨识或检测一种挥发性成分或少数几种挥发性成分的混合物。对于典型挥发性成分的确定或者复杂的实际生物挥发性成分体系的分析而言，GC-MS仍然是优选方法。

3 细菌挥发性代谢产物检测技术的应用

鉴于细菌挥发性成分能被实时快速检测的特点，为许多领域提供了无损检测手段。如在医学研究领域，细菌挥发性成分可以作为病原菌感染导致的疾病的前期诊断指标。Khalid等以存在于口腔舌头生物被膜微生物群中代表性的2种革兰阳性菌和2种革兰阴性菌为对象，采用顶空固相微萃取方式富集目的细菌培养物产生的挥发性成分，经气相色谱-质谱检测。结果表明，口腔中厌氧微生物产生的挥发性物质十分重要，可以将呼出气体作为身体系统疾病或代谢紊乱的判断标记[22]。Goeminne等以28位支气管扩张病人的口痰细菌培养物(铜绿假单胞菌)为对象，采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱(HS-SPME-GC-MS)测定其挥发性成分，通过建立模型对阳性样本和阴性样本的预测值分别达到86%和100%，说明对病人口痰细菌培养物挥发性成分的测定方式可以作为一种慢性肺部感染的快速且早期的筛选方法[23]。然而，这些研究都还处于实验探索阶段，将挥发性成分检测技术直接应用于人体疾病的诊断还有许多方面需要考虑，例如由于炎症反应造成的病人主体与感染细菌之间的相互作用必然会导致挥发性代谢产物的改变；在人体器官自然定殖的细菌会产生相似的挥发性代谢产物以干扰目标致病菌的检测[6]。在食品研究领域，食品营养成分丰富，容易受到微生物污染，从而引起腐败变质和食用不安全性。污染微生物的次级代谢产物会产生特定的挥发性气味物质，基于此可利用气味特征来检测食品中的污染微生物。Horváth等[24]利用电子鼻分析了不同温度下猪肉排骨的细菌数量。Balasubramanian等[25]运用电子鼻检测了20 ℃接种鼠伤寒沙门氏菌后的牛肉气味变化。Abdallah 等[26]采用电子鼻对新鲜牛肉和腊肠的细菌数量以及分别接种大肠埃希菌O157∶H7、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的新鲜牛肉和腊肠的细菌数量进行了分析。通过将电子鼻检测到的气味物质浓度与细菌数量相关联，可以预测食品基质上细菌的生长情况。另一方面，金伟平等[27]运用HS-SPME-GC-MS技术对单增李斯特菌不同污染程度的冷藏牛肉所产生的挥发性物质进行了分析。Jaffrès等[28]采用HS-SPME-GC-MS技术对污染了热杀索丝菌和肉杆菌的煮熟去皮虾仁的挥发性物质进行了分析。Holm等[29]也采用HS-SPME-GC-MS技术对污染了热杀索丝菌和肉杆菌的干腊肠的挥发性物质进行了分析。但目前这些研究并没有将检测到的污染细菌的气味物质与细菌数量相关联。探索污染细菌的气味标记物和气味特征，并建立与细菌生长的关系是今后工作的重点。气体感应技术能有效地用于食品质量控制，但目前该方法还是不能完全替代参考方法——感官评价法。随着技术设计和操作的标准化发展，气体感应技术将在食品污染监测和控制领域有着广阔的应用前景。

4 细菌挥发性代谢产物检测存在的问题

通过文献分析，认为目前BVMs检测技术研究中有以下3个核心但又棘手的问题需要解决：①同种但不同分离源的菌株之间BVMs信号的种类和强度是否存在差异？Kunze等以大肠埃希菌和铜绿假单胞杆菌临床随机分离菌株为研究对象，表明同种但不同分离源的菌株之间，BVMs信号种类和强度变化没有差异[30]，但对于其他分离源的细菌菌株而言，是否具有相似的结论有待进一步研究。目前，正在针对已分离得到不同食品源的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌株，通过检测这些菌株的BVMs以探索同种但不同分离源的菌株之间BVMs的变化。②能否实现对细菌固体培养物VOCs的检测？相比液体培养基而言，微生物在固体培养基中呈现的生长阶段和代谢特征不明显，更难获取。Jünger等[31]分析了大肠埃希菌在内的15种病原菌在哥伦比亚血琼脂平板上的VOCs类型，根据检测的VOCs类型可以成功区分15种目标菌。那么，在食品科学领域，能否通过检测实际固态样品的挥发性产物来判断样品受到何种微生物污染以及受污染程度？结合我们的研究，通过采用顶空固相微萃取-气相色谱/质谱联用技术对猪肉样品上生长的大肠埃希菌O157∶H7的BVMs进行直接检测，结果发现2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮、3-甲基-1-丁醇和吲哚等大肠埃希菌稳定的挥发性成分，同时发现了三十碳六烯和三甲胺等独特的挥发性成分，推测这些成分可以作为大肠埃希菌O157∶H7在猪肉中生长的气味标记物，未来还需要做更深入的研究。③细菌产生的BVMs与基质中细菌数量的关系如何？Bunge 等[3]通过对大肠埃希菌和肠炎沙门氏菌各自释放的特异挥发性产物进行了在线检测，阐明了2种细菌各自特征的挥发性释放类型。Maddula等[32]分析了大肠埃希菌在培养液中的生长代谢活动特征，建立了大肠埃希菌的生物量与顶空代谢物浓度之间的动态相关性。Kunze等[30]对大肠埃希菌的培养物进行了代谢产物随生长的变化研究。采用顶空固相微萃取-气相色谱/质谱联用技术，对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养物不同生长时间点进行动态取样分析，可初步揭示挥发性代谢成分产生的时序特征，为进一步回答这个问题奠定基础。

综上所述，在今后的研究中应该围绕上述3个问题进行全面且系统的探索，这些问题的解决将进一步揭示细菌挥发性代谢产物的释放信息以及与细菌生长的相关性，使得细菌挥发性代谢产物检测技术成为一种实际有效的无损检测方法。同时，可能会发现更多的新的微生物源性挥发性化合物。

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Categories, Detection Techniques and Applications of Bacterial Volatile Metabolites

CHEN Juan, SHI Hui, WANG Qiong, TANG Jun-ni

(Coll.ofLifeSci. &Technol.,SWUni.forNationalities,Chengdu610041)

Bacterial volatile metabolites (BVMs) are important components of metabolites of bacteria, and closely associate with bacterial life activities and their growing amount, they are important information substances for bacteria to communicate with the surrounding various organisms. Categories and characteristic features of BVMs are complicated, it needs and depends special techniques to analyze and test them, because they are in low concentration, large categories, and having great span from polarity to non-polarity. In this paper the category of common BVMs was summed up, and introduced gas chromatography-mass spectrum and electronic nose these two methods for determining volatile organic compounds, exemplified the potential applications of BVMs detection in medical and food research fields, and proposed some crucial problems in BVMs detection study.

bacterial volatile metabolites (BVMs)；category； detection

国家自然科学基金项目(31371781)；教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-11-0847)

陈娟 女，博士，高级实验师。主要从事食品微生物与食品安全方面研究。E-mail：chenj1221@126.com

* 通讯作者。女，博士(后)，副研究员。研究方向为食品安全。E-mail:Junneytang@aliyun.com

2014-05-30；

2014-06-25

Q935

A

1005-7021(2015)01-0089-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.017