家蝇共生真菌的抗菌活性筛选及菌株CY-03的初步鉴定

葛艳琴， 邵明伟， 周 璇， 文 丹， 潘倩倩， 张应烙,2*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004；2.南京大学 医药生物技术国家重点实验室，江苏 南京 210093)



家蝇共生真菌的抗菌活性筛选及菌株CY-03的初步鉴定

葛艳琴1， 邵明伟1， 周 璇1， 文 丹1， 潘倩倩1， 张应烙1,2*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004；2.南京大学 医药生物技术国家重点实验室，江苏 南京 210093)

利用平板分离法从家蝇中分离出14株家蝇共生真菌，活性筛选表明CY-03有较好的抗菌活性，在供试浓度为0.1 mg/mL时，CY-03发酵液乙酸乙酯萃取物对番茄早疫病菌和苹果树腐烂病菌具有较好的抑制作用，抑制率约60%；在供试浓度为30 μg/滤纸片时，与阳性对照相比，乙酸乙酯提取物对枯草芽胞杆菌有中等的抑制作用，抑菌圈直径为21.0 mm。进一步研究CY-03发酵液不同极性溶剂萃取物的抗菌活性，结果表明其活性物质主要集中在中等极性部位，在供试浓度为0.1 mg/mL时，CY-03发酵液乙酸乙酯提取物对苹果树腐烂病菌、杨树溃疡病菌、番茄早疫病菌和苦瓜枯萎病菌等具有较好的抑制作用，抑制率均大于45%；在供试浓度为30 μg/滤纸片时，乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大肠埃希菌有中等的抑制作用，抑菌圈直径范围为14.8～23.0 mm。通过形态学特征观察和5.8S rDNA测序分析，初步确定该菌株为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。CY-03作为微生物源杀菌剂值得进一步研究。

家蝇；共生真菌；抗菌活性；尖孢镰刀菌

微生物是寻找新抗生素的宝贵资源，上世纪人们已从土壤微生物中分离得到很多临床应用的抗生素。由于长期从同样的陆生生境中分离的往往是相同或相似的微生物，且从中分离得到的化合物往往是已知化合物，出现全新骨架活性化合物的几率已经很低。与此同时，近年来制药领域的发展也使得人们对药用活性物质的来源与特性有了更高的要求，已有结构特征的化合物不能适应病原体的快速变化，而传统来源的天然产物发现的途径也难以满足具有新结构特征或新作用特点化合物发现的需要。因此，为了发现新型天然药源分子，寻找新的特境微生物资源显得尤为必要。昆虫共生菌是一类有待开发的特境微生物，目前研究较少，是新颖天然产物的广泛来源[1]。家蝇生活环境恶劣，虽然置身于不计其数的病菌之中，但自身却能安然无恙。一般认为蝇类的抗菌活性与其自身含有的抗菌肽有关[2]，但除此之外，有文献报道昆虫共生菌能帮助昆虫抵抗致病菌的危害[3]，因此，家蝇抵抗致病菌危害可能也与其共生菌有关。在较系统研究大刀螳螂、棉蝗和负蝗共生菌活性代谢产物的基础上[4-6]，活性筛选实验表明1株家蝇共生真菌具有较好的抗菌活性，本文报道该活性菌株并初步确定其分类地位，旨在为开发新型微生物源杀菌剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 供试家蝇捕自浙江师范大学校园内。

1.1.2 供试指示菌 供试植物病原真菌为苹果树腐烂病菌(Valsamali)、杨树溃疡病菌(Dothiorellagregaria)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、苦瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.momordicae)；供试致病细菌为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠埃希菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)。

1.1.3 培养基 ①MEA培养基：生麦芽20 g，加水煮沸30 min，以纱布滤去残渣，滤液加水补足至1 000 mL，加入15～20 g琼脂加热熔化，再加蔗糖20 g及蛋白胨1 g溶解，分装，121 ℃、0.1 MPa灭菌20 min备用。不加琼脂者为相应液体培养基(ME)；②牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，加热熔化，再加水补足至1 000 mL，分装，121 ℃、0.1 MPa灭菌20 min备用。不加琼脂者为相应液体培养基。

1.2 方法

1.2.1 共生真菌的分离及其发酵产物的提取 按参考文献[7]的方法从家蝇中分离共生真菌，将家蝇饥饿24 h后，先用75%酒精表面消毒2 min，无菌水清洗后，按每只家蝇加0.5 mL无菌水于灭菌研钵中研磨均匀，取0.1 mL研磨液均匀涂布在MEA培养基平板上，待1～2 d长出菌落后，按无菌操作程序挑出真菌，接种在MEA培养基上培养，共分离得到14株共生真菌[8]。将分离到的菌株分别接种于装有150 mL MEA培养液的250 mL三角瓶中，30 ℃、150 r/min条件下，摇床培养7 d。所得发酵液经4～8层纱布过滤，滤液分别用乙酸乙酯萃取3次，萃取液经蒸馏浓缩得粗浸膏。

1.2.2 CY-03不同极性溶剂发酵产物的提取 对CY-03进行液体发酵并得到发酵滤液，滤液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液经减压浓缩分别得石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物。

1.2.3 提取物对植物病原真菌的抑菌活性测定 采用生长速率法测定提取物对植物病原真菌的抑制活性，具体操作过程参照冯俊涛等[9]方法。用丙酮定容，使粗浸膏最终质量浓度为1.0 mg/mL。带毒培养基的制备：取所制备的家蝇共生真菌提取物1 mg于灭菌的10 mL试管中，加入9 mL 50 ℃左右MEA培养基，摇匀，倒入灭菌培养皿中即成，使带毒培养基中提取物的最终质量浓度为0.1 mg/mL，以等量丙酮作为阴性对照。将活化的植物病原真菌用无菌平板打孔器打成直径5 mm的菌块，置于培养基上，每处理3次重复，培养3～7 d后，采用十字交叉法测量供试菌菌落直径。按如下公式计算抑制率：抑制率(%)=((对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-5 mm))×100%[10]。

1.2.4 提取物对致病细菌的抑菌活性测定 采用滤纸片法[11-12]测定发酵提取物对致病细菌的抑制活性。提取物用丙酮溶剂配成浓度为6 mg/mL的药液，青霉素、硫酸庆大霉素加蒸馏水分别配成浓度为6 mg/mL作为阳性对照，丙酮作为阴性对照。将细菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，恒温摇床培养1～2 d活化，将上述供试菌充分稀释，用麦氏比浊管对比，配成1×108cfu/mL，吸取200 μL涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，用移液枪吸取5 μL药液滴加到直径为6 mm的无菌滤纸片上，相同药剂处理3次，待溶剂完全挥发后放入上述制备好的固体培养基中，置于28 ℃培养箱中培养1～2 d，观察是否产生抑菌圈，并采用十字交叉法测量抑菌圈的直径[13]。

1.2.5 CY-03菌株鉴定 采用形态特征和DNA测序相结合的方法鉴定CY-03菌株。首先观察CY-03菌株的菌落形态，挑取少量菌落制片，用生物显微镜观察菌株孢子的形态特征；同时，将培养好的CY-03新鲜菌体作为DNA提取的材料，按照生工SK1201-UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒说明书提取，使用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增5.8S rDNA序列，将PCR产物纯化后送上海生工公司测序，测序结果进行BLAST比对分析，选取相似序列，利用MEGA 5.0软件构建系统发育树，确定CY-03菌株的种属分类地位。

2 结果与分析

2.1 家蝇共生真菌提取物对4种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用

14株家蝇共生真菌发酵液的乙酸乙酯提取物对4种植物病原真菌生长的抑制结果见表1。实验结果表明，当供试浓度为0.1 mg/mL时，CY-03对番茄早疫病菌和苹果树腐烂病菌的抑制率约为60%；CY-01、CY-05、CY-06、CY-09、CY-10、CY-11和CY-13仅对其中1种供试菌的抑制率大于60%；其他共生真菌的抑制率较差，均在60%以下。

表1 14株共生真菌提取物对4种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用

注：提取物供试浓度为0.1 mg/mL；“a”表示菌落直径(mm)；“b”表示抑制率(﹪)；结果表示为抑制率±3个平行测量值的标准差；CK为阴性对照，表3同

2.2 家蝇共生真菌提取物对4种致病细菌生长的抑制作用

14株家蝇共生真菌发酵液的乙酸乙酯提取物对4种致病细菌生长的抑制结果见表2。实验结果表明，当每滤纸片上药品含量为30 μg时，CY-03对枯草芽胞杆菌有较好的抗菌活性，抑菌圈达21.0 mm，与阳性对照青霉素和硫酸庆大霉素效果相当；其他共生真菌对供试菌的抑菌效果较弱，抑菌圈直径均小于14.0 mm。

2.3 CY-03不同极性提取物对4种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用

家蝇共生真菌CY-03发酵液的不同极性溶剂的提取物对4种植物病原真菌生长的抑制结果见表3。实验结果表明，当供试浓度为0.1 mg/mL时，乙酸乙酯提取物对苦瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、苹果树腐烂病菌和杨树溃疡病菌等4种植物致病真菌抗菌活性最好，抑制率均大于45%；其他提取物的抗菌活性都不高，抑制率均小于45%。因此，CY-03发酵液的抗真菌活性物质主要集中在中等极性的乙酸乙酯部位。

表2 14株共生真菌提取物对4种致病细菌生长抑制作用的抑菌圈直径(mm)

注：供试浓度为30 μg/滤纸片；结果表示为抑菌圈大小±3个平行测量值的标准差，表4同

表3 CY-03不同极性提取物对4种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用

2.4 CY-03不同极性提取物对4种致病细菌生长的抑制作用

家蝇共生真菌CY-03发酵液不同极性溶剂的提取物对4种致病细菌生长的抑制结果见表4。实验结果表明，当每滤纸片上药品含量为30 μg时，乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等3种致病细菌的抗菌活性较好，抑菌圈直径范围为14.8～23.0 mm；正丁醇萃取物抗菌效果次之，抑菌圈直径范围为10.2～15.5 mm；石油醚提取物和水提取物的抑菌活性较差，抑菌圈直径均小于16.5 mm。因此，CY-03发酵液的抗细菌活性物质主要集中在中等极性的乙酸乙酯部位。

2.5 CY-03菌种鉴定

2.5.1 形态学鉴定结果 在MEA培养基上，CY-03菌株菌落呈圆形，质地均匀，紧贴平板，生长旺盛，基内菌丝呈暗红色，气生菌丝为白色绒状，能产生大、小型分生孢子，大型分生孢子有隔膜，卵圆形至镰刀形，小型分生孢子着生于单生瓶梗上，常在瓶梗顶端聚成球团，单胞。参考文献[14-15]，CY-03与尖孢镰刀菌形态较一致。

2.5.2 5.8S rDNA序列分析 将CY-03菌的5.8S rDNA基因序列通过BLAST比对，发现CY-03序列(GenBank中保存号为KJ645965)与尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumJQ701799)的同源性高达99%，在系统发育树上处于同一分支(图1)，结合形态学鉴定，最终确定CY-03为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。

表4 CY-03不同极性提取物对4种致病细菌生长抑制作用的抑菌圈直径(mm)

图1 基于5.8S rDNA 基因序列构建的菌株CY-03与镰刀菌属相关菌株之间的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on the 5.8S rDNA gene sequences of CY-03 and Fusarium′s related strains

3 讨 论

本实验从家蝇分离得到14株共生真菌，活性筛选表明CY-03具有较好的抗菌活性，进一步活性测试表明CY-03的乙酸乙酯提取物对苦瓜枯萎病菌、苹果树腐烂病菌、番茄早疫病菌、杨树溃疡病菌等4种真菌有中等的抑菌活性；对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等3种细菌也有中等的抑菌活性。因此，菌株CY-03具有开发成微生物源抗菌剂的潜力，值得进一步研究。至于CY-03菌株的活性成分的分离鉴定、活性作用机理等，还有待于进一步的研究探讨。

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Screening of Antimicrobial Active Substance from Symbiotic Fungi in Housefly and Initial Identification of Strain CY-03

GE Yan-qin1, SHAO Ming-wei1, ZHOU Xuan1, WEN Dan1, PAN Qian-qian1, ZHANG Ying-lao1,2

(1.Coll.ofChem. &LifeSci.,ZhejiangNormalUni.,Jinhua321004; 2.StateKeyLab.ofPharm.Biotech.,NanjingUni.,Nanjing210093)

Fourteen housefly symbiotic fungi were isolated from the gut of housefly by means of spread plate isolation method. Screening of activity showed that strain CY-03 showed better antimicrobial activity, under tested concentration at 0.1 mg/mL, the acetic acetate extract (AAE) of CY-03 fermented broth had preferable antifungal activity against pathogens of tomato early blight, apple canker with inhibition rate at 60%; when the tested concentration was at 30 μg/filter paper, as compared with positive control, AAE had medium inhibition againstB.subtiliswith inhibition ring at 21.0 mm. The antimicrobial activity of CY-03 fermented broth extracted with different polar solvent was further studied, the results showed that the active substances were focused on the parts of medium polarity, when the tested concentraion was at 0.1 mg/mL, the AAE of CY-03 fermented broth had better inhibition against the pathogens of poplar ulcer, tomato early blight, and balsam pear firing with inhibition rate of over 45%; when the tested concentration was at 30 μg/filter paper, the AAE had medium inhibition againstStreptococcusaureus,Bacillussubstilis, andE.coli, with inhibition rings ranged at 14.8～23.0 mm. The strain was initially identified asFusariumoxysporummorphologically and through 5.8S rDNA sequence analysis. CY-03 is worthy to study further as antimicrobial preparation of microbial resources.

housefly; symbiotic fungi; antimicrobial active substance;Alternariasolani

国家自然科学基金项目(21272215)；南京大学医药生物技术国家重点实验室开放课题(KF-GN-201302)；浙江

省高等学校中青年学科带头人学术攀登项目(pd2013059)；浙江省大学生科技创新活动计划资助项目(2013R404029)

葛艳琴 女，本科。主要从事应用微生物学研究。E-mail:geyanqin2014@163.com

* 通讯作者。男，副教授，博士。研究方向为应用微生物学。Tel:0579-82286419,E-mail:ylzhang@zjnu.cn

2014-03-03；

2014-04-15

Q939.1

A

1005-7021(2015)01-0061-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.012