二元信号系统的研究进展

李宏波　赵立斌

二元信号系统的研究进展

李宏波赵立斌

【关键词】二元信号系统;组氨酸激酶;应答调节蛋白;抗生素耐药性;抑制剂

作者单位: 066300河北省抚宁县人民医院

二元信号系统(two-component signaling system，TCSS)是一种普遍存在于细菌中的重要的信号传导系统，也是基因表达的重要调控系统［1，2］。病原菌在感染宿主的过程中，能通过该系统密切感受和应答体内外各种微环境的变化，进而调节各种基因表达以完成其致病过程［3］。因此，全面系统地了解和掌握TCSS的结构功能和作用机制及病原菌毒力基因、耐药基因等的表达调控机制，将大大地促进我们对病原菌致病机理的认识，也有助于我们深入地了解细菌耐药性形成机制，为临床诊断、治疗和预防病原菌感染提供依据，为开发新型抗细菌耐药性药物提供指导。

1　概述

1.1二元信号系统的结构二元信号系统(TCSS)在病原菌中起着“神经系统”的作用，是细菌感受和应答外界信号的物质基础。它主要由接受并传递信号的跨膜组氨酸激酶(histidine kinase，HK)和调控靶基因表达的胞浆应答调节蛋白(response regulator protein，RRP)组成［1－4］。典型的HK含有一个长度约500个氨基酸的可变的N端感受域和一个长度约250个氨基酸的C末端传导结构域，传导结构域含有自体磷酸化的靶点即组氨酸的二聚体结构域(H box)和包含N、G1、F和G2盒的ATP结合激酶结构域。应答调节蛋白RRP具有比较保守，长度大约为125个氨基酸的氨基端调节结构域，该结构域含有固定不变且可被磷酸化的Asp残基。但还有一部分RRP除次之外尚含有C末端输出结构域，与调节结构域相比，输出结构域的序列变化较大［5，6］。

1.2二元信号系统的信号传导模式及功能二元信号系统的信号传导通路由信号输入、HK自身磷酸化、RRP磷酸化及信号输出等环节构成［3，4，7］。首先，跨膜的HK通过信号感受域敏锐地感受到外界环境的变化，并催化传导结构域上的His残基发生ATP依赖的自体磷酸化。其次，磷酸基团从高能磷酸化的His残基转移至RRP的Asp残基。最后，磷酸化RRP与下游的目标启动子结合，从而调控目的基因的表达或使目标蛋白的功能发生适应性变化。

通过信号传导通路，TCSS能够参与调节一系列生物应激反应［8］，包括渗透压、光合作用、趋化现象、代谢物利用、生物发光、芽胞形成、细菌生长与成活、致病性以及抗生素耐药性等多个方面。因此，全面系统地了解和掌握TCSS与细菌生长繁殖、毒力因子表达、耐药性的关系，可以促进我们对病原菌致病机理及细菌耐药性形成机制的认识，为临床诊断、治疗和预防病原菌感染提供依据。

2　二元信号系统与细菌生长繁殖、毒力因子表达、耐药性的关系

2.1二元信号系统与细菌生长繁殖病原菌的生长繁殖是其完成致病过程的最基本条件。在条件致病性枯草芽胞杆菌全基因组编码的34个TCSS中，只有YycG/YycF对该菌的生长是必需的，可能是由于YycG/YycF能够参与调控细胞的分裂过程［9］，在金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和肺炎链球菌中也发现了YycG/YycF，可能是由于YycG/YycF二元信号系统TCSS在维持细菌细胞膜的完整性和通透性方面具有重要作用［10］。TCS02是肺炎链球菌中唯一与细菌生长存活密切相关的二元信号系统，近年的研究结果显示，TCS02能够参与细胞壁和脂肪酸的形成［11］。流感嗜血杆菌中的ArcB/ArcA和幽门螺杆菌中的HP1365/HP1364二元信号系统也都能够参与调控细菌的生长［12］。

另外，幽门螺杆菌中的CheA/CheY二元信号系统能够调控自身的趋化和定植，而CheA和CheY突变株虽有动力，但不能定植于小鼠胃粘膜，无定植作用［13］。沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌等革兰氏阴性菌在致病过程中可通过PhoQ/PhoP TCSS诱导特异基因PagP的转录，进而引起细菌外膜结构的改变，如对脂多糖(LPS)的脂质A进行特异修饰，从而增强细菌的抵御宿主抗微生物因子的渗透屏障［14，15］。

2.2二元信号系统与细菌毒力因子表达病原菌在感染宿主细胞的过程中，为了完成致病过程需要表达多种毒力因子。如金黄色葡萄球菌的致病机制与它所表达细胞外毒素、蛋白酶、胞壁黏附蛋白、a-毒素、δ-溶血素、脂酶和凝固酶等毒力因子有关。目前，在金黄色葡萄球菌中已经发现有AgrC/AgrA、SaeR/SaeS、SrrA/SrrB、ArlR/ArlS等二元信号系统能够上调与上述毒力因子相关的基因的表达［16，17］。而且，agr信号系统中AgrC/AgrA二元信号系统能够调控粪肠球菌明胶酶(GelE)和丝氨酸蛋白酶(SprE)两个重要致病物质的产生［18］。

另外有研究发现，CovS/CovR在调节表达化脓性链球菌溶血素S、链激酶、致热外毒素B以及荚膜等致病物质中具有非常重要的作用［19］。产气荚膜梭菌的VirR/VirS［20］和弗氏志贺菌的EnvZ/OmpR分别能够调控外毒素和内毒素的产生。百日咳杆菌的BvgS/BvgA也能够参与多种毒力因子表达的调控［21］。

2型猪链球菌是一种重要的人畜共患传染病病原体，它的感染不仅可致猪患急性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎甚至急性死亡，而且可通过伤口和呼吸道等途径传播，导致人的感染。Li等［22］研究发现二元信号系统SalK/SalR能够调控高致病性2型猪链球菌的毒力，SalK/SalR的缺失能够导致该菌丧失对宿主动物的致病性。

2.3二元信号系统与细菌耐药性除了直接调控上述信号表达外，有些TCSS还能够介导甚至主导致病菌产生抗生素耐药性。大肠杆菌是目前发现外排泵最多的一种细菌，如AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr、OacE等主动外排系统，其中AcrAB-TolC外排泵是其中最主要、占绝对优势的多药外排系统，其过量表达可使大肠杆菌对四环素、氯霉素、红霉素、β-内酰胺类抗生素、利福平和氟喹诺酮类等的耐受［23］。AcrAB的表达水平受多种调控因子的调节，如acrR、marA、mppA、sdiA，rob和soxS等，大肠杆菌EvgS/EvgA能够正向调控AcrAB-TolC外排泵及emrKY、yhiUV和mdfA等药物外排基因的表达，降低大肠杆菌对药物的敏感性，从而导致大量的多药耐药菌株的出现［24］。SoxS也是一个正向调控因子，可激活包括编码多重抗生素耐药性操纵子的marAB、acrAB、tolC、micF和rimK基因等17个基因的表达，增强大肠杆菌对一系列抗生素的耐受性，使其对多种药物的耐药性增强［25］。

Fan等［26］通过重组表达CiaH、CiaR、ComD、ComE 和ComC 5个基因产物，并分别制备其抗血清，发现CiaH和CiaR被抗血清封闭后，敏感菌株可出现对青霉素和头孢胺噻的耐药性，但对耐药菌株耐药性无明显影响。ComD或ComC被抗血清封闭后，头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性，但耐药菌株耐药性无明显改变，也不影响各菌株对青霉素的耐药性，说明肺炎链球菌的CiaH/CiaR和ComD/ComE与该菌对青霉素和头孢胺噻的耐药有关。另外，肺炎链球菌的VncS/VncR、粪肠球菌的VanS/VanR和耐万古霉素肠球菌的VanS/VanR都能够调控细菌的万古霉素耐药，而脆弱拟杆菌的RprX/RprR能够调控细菌的四环素耐药。结核分枝杆菌的SenX3/RegX3和PknH/EmbR分别是调控katG和embA/embB基因的TCSS，能够调控其对异烟肼和乙胺丁醇的耐受性［27］。

3　二元信号系统抑制剂的研究进展

目前已经开发了许多种组氨酸激酶抑制剂，包括有反式脂肪酸类、异噻唑啉酮类、咪唑鎓盐类、环己烯衍生物类、苯并噁嗪衍生物类、苯并咪唑衍生物类、双酚甲酯类、水杨酰苯胺类、二芳基三唑类、邻苯二酰基酸类、漆树酸衍生物类、环肽类、链霉素类、肽类等［28］。根据TCSS抑制剂作用靶位的不同，可以分为以下四类。

3.1组氨酸激酶信号识别抑制剂金黄色葡萄球菌agr系统中的AgrC/AgrA二元信号系统，可以调控编码毒力因子基因和抗生素耐药基因的表达，并且会调控产生一个被称为AIP自诱肽的七到九肽的硫代内酯，自诱肽可通过酰化AgrC激酶信号感应区的生物亲和试剂，活化agr系统的循环。根据AIP-激酶的特异性，金黄色葡萄球菌菌株可以被分成四大类，每一个AIP可以活化自身的AgrC激酶，但是自身的AgrC激酶的抑制需要其它菌株AIP的作用。有关AIP信号肽结构功能的研究发现，用不易于发生亲核反应的内酯或内酰胺代替AIP结构中的硫代内酯，会形成一些不能活化自身但可以抑制其它菌株agr系统的抑制剂［16，29］。

3.2组氨酸激酶自体磷酸化抑制剂组氨酸激酶抑制剂对自体磷酸化的抑制有多种机制［28］，包括抑制激酶的二聚体作用;抑制激酶反应的H-box或催化区;或者与ATP竞争性结合ATP结合区。第一个被文献报道的自体磷酸化抑制剂是从蛋黄里面提取的L-a-溶血性磷脂酰胆碱，它能够抑制枯草芽孢杆菌中组氨酸激酶KinA的活性。

另外，有研究发现，磷酸转移酶四螺旋束很可能是组氨酸激酶在自体磷酸化结构域部位形成二聚体的主要位点。Stephenson等［30］在体外实验中观察到氯氰碘柳胺和RWJ-49815这两种药物能够选择性抑制枯草芽孢杆菌KinA激酶的自体磷酸化作用，它们很可能是通过插入到磷酸转移酶四螺旋束的核心，暴露出其疏水表面，从而阻止二聚体的形成。

Matsushita等［31］研究发现1-苄基-3-十四烷基-2-甲基咪唑-1-溴化物是一种通用的二组分系统抑制剂，能够强烈的抑制可溶性组氨酸激酶CheA、NRII和KinA的活性，同时也能够抑制具有磷酸化活性的跨膜蛋白激酶VirA。另外，从链霉菌属的发酵产物中分离出的卤代吡咯苯并噁嗪类物质，能够抑制NRII的自体磷酸化，并且对细菌和真菌有一定的杀伤作用［32］。

咪唑鎓盐及其类似物在大约100 μmol/L时能够抑制组氨酸激酶CheA、NRII和KinA的活性。最近，一系列结构类似于咪唑鎓盐的化合物被证实有抑制组氨酸激酶EnvZ、PhoQ、BvgS和EvgS等的活性［33］，其中有一种物质分别在0.78、0.39和3.12 μg/ml时能够显著抑制耐苯唑西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及肺炎链球菌的生长。

3.3应答调节蛋白磷酸化抑制剂目前，已经证实芳基硫代吡咯烷酮能够抑制磷酸基团从组氨酸激酶到应答调节蛋白的转移［34］。通过重组表达VanS和VanR蛋白，模拟VanS/VanR二元信号系统的体外环境，发现芳基硫代吡咯烷酮是可以抑制VanR的接收活性而不是磷酸化的VanS的供给活性，并且只有在高浓度时(半数有效量为0.35 mM)才可以起到抑制作用。

3.4应答调节蛋白与启动子相互作用抑制剂Matsushita等［31］通过凝胶迁移率变动分析实验，发现1-苄基-3-十四烷基-2-甲基咪唑-1-溴化物在大约150 μmol/L时能够抑制AlgR1与algD启动子的结合，并且它是能够抑制algD启动子的特异性抑制剂，它不同于抑制DNA-蛋白质相互结合的非特异性的抑制剂，主要是因为它缺乏CatR结合到catBC启动子上的活性。

4　问题与展望

目前为止，国内外针对TCSS进行的药物开发研究还处于起步阶段，虽然已经建立了许多个药物化学库来筛选TCSS抑制剂，但大多数抑制剂都是针对组氨酸激酶的，特异性不强，可能会对人类造成损伤，而且，目前大多数化合物都存在溶解性低或是疏水性的问题，这其中最大的原因可能是由于这些药物的药效基团不合适，或者，这些化合物是在筛选的过程中被错误判断的。在基于底物设计的TCSS抑制剂的经典方法中，稳定的磷酸化组氨酸模型化合物需要被整合成小肽，但同源组氨酸的合成已经成为固相合成这些肽类的最大障碍［35］。

鉴于药物化学库里缺乏TCSS抑制剂的备选药物，一些专家和学者开始采用新的策略来筛选和鉴定TCSS抑制剂。目前，已经证实通过使用X射线或核磁共振NMR法并且结合着计算机技术来研究HK胞内区的方法［36］，可以用来从化合物库中筛选先导化合物，并且，这种方法还可以解决药物的疏水性问题。新型CheA激酶的N-乙酰化的、C-酰胺化的、D-型氨基酸的六肽抑制剂是通过反复筛选和单位点扫描矩阵相结合的方法被发现，它在8 μmol/L时能够抑制CheA激酶73%的自体磷酸化，并且有一定的抗革兰阴性病原菌的活性［37］。同时，通过类比于酪氨酸激酶抑制剂的开发，对TCSS中的组氨酸激酶进行合理药物设计方法的建立也是很有必要的。

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(收稿日期:2014－12－09)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.041

【文章编号】1002－7386(2015) 08－1229－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R 378