壳聚糖和鱼精蛋白对淡水污损黏附菌的抑制作用

刘念+熊燕飞+彭俊讲+许瀚之+廖立菁+蔡小雨+许云

摘要：水下固形物表面微生物的黏附生长是生物污损层形成和生物腐蚀的初级阶段。从长江水体分离得到三株淡水黏附菌，在前期对其形态特征进行研究的基础上，对其黏附生长进行了初步研究，探讨了壳聚糖和鱼精蛋白两种物质对它们生长、黏附的抑制作用。结果显示，3种菌株在玻璃片上能迅速黏附，壳聚糖与鱼精蛋白处理菌体后能明显改变菌株生长或黏附情况；处理材料表面后能显著改变材料表面能，引起不同的微生物黏附现象。

关键词：淡水黏附菌；壳聚糖；鱼精蛋白；细菌生长；黏附

中图分类号：O636.1；Q939.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）01-0027-04

水下设施及船体表面形成的生物污损层[1]是由多种生物及其附属物构成的开放生态系统。研究表明，放在海水中的任何物体表面很快就被单层的有机质所覆盖，称为调节膜[2]，其后，细菌和其他微小的浮游生物，如原生动物和各种微藻及其孢子等开始黏附，这些微生物在调节膜的滋养下形成生物膜[3，4]，最先附着的微生物的生长会增加表面的粗糙度和疏水性[5]，防垢层表面的有机物又能作为微生物再生长的碳源[6]，进一步引导海绵、水螅、海藻、石灰虫以及藤壶、贝类等次级附生物附着。生物污损是不可逆的，会导致膜的损坏从而增加操作成本[7]，给航运、海防及水产养殖等行业带来巨大的经济损失和安全隐患。

壳聚糖薄膜的润湿性与膜表面的粗糙度有关，自然干燥的膜具有较大的粗糙度，稳定的具有微纳米结构的壳聚糖膜有望成为防污、防水、防雾、自清洁、无损运输等良好的膜材料[8，9]。

本试验重点研究了壳聚糖、鱼精蛋白及利用它们改性之后的材料对分离得到的三种淡水黏附菌的生长、黏附带来的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

试验菌株：长江武汉市段黄鹤楼轮渡引桥水线下约20 cm处悬片取样分离的菌株，分别记为AB-w，AB-y，AB-ly，作为试验菌株。

培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基，牛肉膏蛋白胨液体培养基。

主要试剂：壳聚糖，平均相对分子质量300.00，脱乙酰度85%（青岛海洋研究所）；硫酸鱼精蛋白，生化试剂（BR，国药集团化学试剂有限公司）；戊二醛，分析纯（AR，国药集团化学试剂有限公司）；其他常用试剂均为分析纯（AR）。

1.2 方法

1.2.1 试验菌株的分离培养与纯化 长江武汉市段黄鹤楼轮渡引桥水线下约20 cm处，悬挂灭菌载玻片，分别于0.5、1 、2 、6、24 h取出，采用影印法，将载玻片上菌体印迹至牛肉膏蛋白胨固体平板上，37 ℃恒温培养24 h，观察比较挂片不同时长后玻片黏附菌的数量及种类。选取优先黏附、数量较多的菌落，用平板划线法进行二次分离纯化，革兰氏染色观察。

1.2.2 试验菌株的生长、黏附观察 将试验菌株从37 ℃过夜活化牛肉膏蛋白胨固体斜面保种管中取两环，接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃，100 r/min空气摇床培养3 h后作为菌液。

取菌液700 μL加入50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，分别添加700 μL无菌去离子水、20 mg/mL壳聚糖溶液、10 mg/mL鱼精蛋白溶液，每瓶培养基中以铜丝笼置入两片盖玻片，37 ℃，100 r/min空气摇床培养。到预定时间后观察培养基情况后将盖玻片取出，以4 mL无菌去离子水轻轻冲洗两面后，在无菌滤纸上晾干，取未接触滤纸一面连续两次印迹于牛肉膏蛋白胨固体平板上，37 ℃培养24 h。

1.2.3 壳聚糖和鱼精蛋白对试验菌株的抑制生长观察 取200 μL菌液，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基表面，略微静置，分别滴加50 μL 100.0、33.3、20.0 mg/mL壳聚糖溶液与10.0 mg/mL鱼精蛋白溶液，37 ℃培养24 h。

1.2.4 壳聚糖溶液对菌株生长的影响 利用96孔细胞培养板探究不同浓度壳聚糖溶液对菌株生长的影响。设置空白培养液组及试验菌株培养组，调节壳聚糖终浓度分别为0.000 0、0.037 5、0.075 0、0.150 0、0.300 0、0.600 0 mg/mL，每个浓度4次重复，每孔溶液总量100 μL。酶标仪中等强度振荡10 s后630 nm处测量每孔的吸光度，37 ℃静置培养20 h后重复测量。

1.2.5 改性材料检测及微生物黏附情况观察 盖玻片经高温蒸气灭菌，浸入1%戊二醛溶液中，60 ℃恒温水浴1 h。取出后放入15 mL无菌去离子水中浸洗3次，无菌滤纸上晾干。分别置入现制的6 mg/mL壳聚糖溶液、20 mg/mL鱼精蛋白溶液、无菌去离子水中，4 ℃静置8 h，取出晾干，置于无菌培养皿中暂存。

将处理后的材料分为4组，一组以水在空气中测量接触角，重复测量5次，运用MATLAB R2012a，根据改进的Berthelot规则[10]，计算材料表面能。

取两组以铜丝笼固定，于武汉市黄鹤楼轮渡引桥处水线下分别悬吊15、30 min取出，以少量无菌去离子水冲洗表面杂质后自然干燥，其中30 min组经结晶紫简单染色后使用奥林巴斯倒置荧光显微镜观察，15 min组与剩下一组材料使用Hitachi S-4800场发射扫描电镜观察。

2 结果与分析

2.1 试验菌株分离结果

获得3种主要菌株，根据菌落颜色分别命名为AB-w（Adhesion bacteria-white），AB-ly（Adhesion bacteria-light yellow），革兰氏染色阴性；AB-y（Adhesion bacteria-yellow），革兰氏染色阳性。

2.2 试验菌株生长、黏附情况

3种试验菌株在添加有壳聚糖溶液（终浓度0.30 mg/mL）的培养瓶中培养，开始时无明显异常，37 ℃摇床培养1 h后皆出现絮状沉淀，培养基明显较空白对照组清澈。而添加有鱼精蛋白溶液（终浓度0.14 mg/mL）的培养瓶明显较空白对照组浑浊。如图1所示，AB-y、AB-w菌株与AB-ly菌株情况类似。前期试验结果显示3组培养瓶在添加相应溶液之前菌体数量无数量级差异，推知此现象为添加相应溶液所引起，若降低壳聚糖终浓度至0.20 mg/mL则无明显絮状沉淀出现。endprint

通过与对照组对比可知，在培养时间为1 h时，添加壳聚糖可以部分减少AB-ly、显著抑制AB-y在盖玻片上的黏附；添加鱼精蛋白可以有效减少AB-ly、明显抑制AB-y在盖玻片上的黏附；而两种物质对AB-w均无明显的抑制黏附作用。若缩短培养时间为15 min，两种物质对AB-y的抑制黏附作用明显减弱，如图2所示。推知0.14 mg/mL的鱼精蛋白溶液对于AB-ly、AB-y的抑制黏附效果优于0.30 mg/mL壳聚糖的效果。实验室条件下培养时间适当延长可以增强两种物质抑制AB-y黏附的效果。

2.3 抑菌圈大小

3种菌株对于两种物质的敏感性不一。其中AB-y、AB-ly对于两种物质的敏感性类似，随着壳聚糖溶液浓度的降低，溶液黏度明显降低，抑菌圈增大较明显；10.0 mg/mL的鱼精蛋白溶液可以显著抑制两种菌的生长。对于AB-w，3种浓度下壳聚糖抑制效果不明显，鱼精蛋白抑制效果一般（图3）。

2.4 低浓度壳聚糖溶液对菌株生长的影响

大幅度降低壳聚糖浓度后，3种菌株的反应不同。AB-y生长未受明显影响；AB-ly在浓度为0.300 0 mg/mL前生长有小幅增强，0.300 0 mg/mL后生长受到抑制；AB-w在试验浓度下都出现受抑制现象，随着浓度的升高抑制效果增强，在0.150 0 mg/mL到0.300 0 mg/mL区间内变化显著，随后变化幅度的降低。结合抑菌圈试验推知为得到良好的抑制生长效果，AB-y需要较高的壳聚糖溶液浓度，AB-ly相对较低，AB-w最低。过高的壳聚糖溶液浓度因为其黏度的显著增加会明显降低抑制生长效果（图4）。

2.5 改性材料性质及微生物黏附情况对比

盖玻片经过改性后，材料表面能发生明显变化，如表1和图5所示。从表1和图5可以看出，戊二醛处理后，材料接触角稍微变大，表面能略有降低，疏水性小幅增加；戊二醛与壳聚糖共同处理后，材料接触角明显变大，表面能显著降低，表现为疏水性；戊二醛与鱼精蛋白共同处理后，鱼精蛋白的加入使得材料接触角、表面能、疏水性都与未经处理的盖玻片类似。

如图6所示，从材料在江水中悬吊前后的扫描电镜结果可以看出，浸泡之前，在放大20 000倍下空白对照可以看到明显的划痕；戊二醛处理后材料表面存在部分块状物；壳聚糖溶液处理后材料表面存在明显的膜状物，可解释为壳聚糖膜干燥过程中，随着溶剂及水分的蒸发，壳聚糖在溶液状态下较为伸展的分子链由于脱溶剂化而不断卷曲，分子链间的缠绕或结合趋于紧密。自然干燥条件下壳聚糖溶液蒸发速率较低，干燥时间长，分子链得到了充分卷曲和缠绕，因此形成膜的晶粒较粗大，使得薄膜结构粗糙[9]；鱼精蛋白溶液处理后可看到部分不规则颗粒。在江水中悬吊浸泡15 min之后，材料表面都发生了较大变化。其中以空白对照最为明显。

比较之后可以发现经过壳聚糖与鱼精蛋白处理过后的材料表面虽然有层状堆积，但层状堆积大小不一，堆积无明显规律，堆积较松散，悬吊前原有结构被层状堆积覆盖依稀可见；空白对照层状堆积明显，有一定的规律性，原有结构无法分辨；戊二醛处理组原本块状物消失，出现成片的堆积物。

从倒置荧光显微镜下观察悬吊材料可知，不同处理后微生物的黏附情况有很大不同。其中空白对照吸附有大量的细菌，细菌间无明显聚集成团现象，细菌排列有一定的规律，无其他微生物的黏附；戊二醛处理材料表面细菌数量较少，分布较散，无明显规律性，无其他微生物黏附；壳聚糖处理材料表面有多种微生物黏附，存在明显的聚集成团现象，细菌黏附相对较少；鱼精蛋白处理材料无多种微生物黏附现象，细菌黏附相对较少，部分分散，部分存在多个细菌有序排列成三叉状（图7）。推测上述现象是由于戊二醛处理后一定程度上降低了细菌对材料的黏附，有机物壳聚糖由于良好的成膜性，在材料表面形成了一层有机膜，一定程度上吸引了比细菌高等级的微生物的黏附；鱼精蛋白在材料表面分散分布，不会形成明显的有机膜，所以不像壳聚糖处理材料那样会黏附其他种类的微生物，而且由于鱼精蛋白的存在，导致部分细菌发生比较规律的聚集。猜想壳聚糖与鱼精蛋白处理后随着时间的延长，这些聚集的细菌会被剥落，从而达到抑制细菌黏附的作用。

3 小结与讨论

1）壳聚糖与鱼精蛋白对分离得到的3种黏附菌确实有一定的抑制生长或黏附的作用，但是分离得到的3种黏附菌间对于壳聚糖及鱼精蛋白处理后的响应具有一定的区别。0.14 mg/mL鱼精蛋白对抑制AB-y与AB-ly的黏附效果较好，对AB-w没有明显的抑制效果。10.0 mg/mL鱼精蛋白对AB-y与AB-ly有着相似的抑制生长作用，但是对AB-w作用一般。为得到良好的抑制生长效果，AB-y需要较高的壳聚糖浓度，AB-ly相对较低，AB-w最低。

2）针对AB-y菌株，相同浓度的壳聚糖与鱼精蛋白溶液处理下，适当延长培养时间更有利于抑制AB-y在材料表面的黏附。

3）材料经过处理后有了明显的改变，壳聚糖处理的材料表现出较强的疏水性，鱼精蛋白处理的材料表现出较强的亲水性，二者都能显著改变微生物在其表面的黏附状态。

4）壳聚糖与鱼精蛋白抑制分离得到的3种黏附菌生长或黏附的最佳浓度还有待进一步确认，鱼精蛋白抑制黏附的浓度不同可能对促进细菌生长的效果不同。

5）壳聚糖与鱼精蛋白处理材料的方法、材料的耐久性以及抑制黏附的机理还需要进一步探究。这二者的共同点是带有大量的正电荷，这一点可能是抑制细菌黏附，避免生物污损的一个方法。

参考文献

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