金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒检测分析

王书冉, 高艳芳， 张　良， 刘　洋， 万　青， 吕　宁

(新郑市疾病预防控制中心 检验科，河南 新郑451150)



金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒检测分析

王书冉, 高艳芳， 张良， 刘洋， 万青， 吕宁

(新郑市疾病预防控制中心 检验科，河南 新郑451150)

[摘要]目的探讨金黄色葡萄球菌肠毒素的检测方法，为食物中毒处理提供依据。方法以食物样本为实验材料， 按照GB/T4789.10-2003，对样品进行金黄色葡萄球菌检测及计数，并对相关肠毒素基因SEA、SEB、SECs进行PCR扩增。结果实验标本进行染色镜检，结果为革兰阳性金黄色葡萄球菌，血浆凝固酶试验阳性，菌落为8.5×107cfu/g，实验标本发现SEA、SEB、SECs基因。结论金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SECs基因可能是该例食物中毒的原因，加强金黄色葡萄球菌及其肠毒素的检验是迫切需要解决的一个问题。

[关键词]金黄色葡萄球菌；肠毒素 ；食物中毒

金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是引起人类食物中毒最常见的病原菌，产生的毒素主要有肠毒素、杀白细胞毒素、表皮剥脱毒素等，侵袭性酶类有血浆凝固酶、脂肪酶、透明质酸酶和溶纤维蛋白酶。一旦毒素在体内大量集聚，可以造成炎症反应，如肺炎、心包炎、肠炎等，严重可造成多器官功能障碍。根据我国近年对食源性疾病的分析，大部分由金黄色葡萄球菌肠毒素引起[1]。笔者就新郑市发生的1例由金葡菌的食源性中毒进行分析，采用PCR方法检测3种肠毒素基因(SEA、SEB、SECs)。

1材料和方法

1.1流行病学调查某人在食用不洁食物后，发生恶心、呕吐、腹痛、腹泻、发热等症状。 通过流行病学调查，确诊为金黄色葡萄球菌污染引起的食物中毒。

1.2检测方法

1.2.1实验标本以送至新郑市疾病预防控制中心进行检查的食物样本为实验材料。

1.2.2标准菌株金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、表皮葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌购自中国药品生物制品检定所。

1.2.3主要仪器及材料数控恒温水浴槽、恒温培养箱、低温冷冻高速离心机、PCR扩增仪、自动凝胶成像分析系统、氯化钠肉汤、Baird-Parker琼脂、营养肉汤、冻干血浆、新鲜羊血、PCR试剂、硼酸、溴化乙啶、EDTA。

1.2.4引物(1)SEA引物为： 5’-AGTCTGAATTGCAGGGAACAGC-3’，扩增产物大小288bp。(2)SEB引物为：5’-TAGTTATTTCTACACCCAACG -3’，扩增产物大小641bp。(2)SECs引物为：5’-TGGTGCAGGCATCATATCATACC-3’，扩增产物大小641bp。

1.3实验方法

1.3.1标准菌株复苏用0.5 mL BP溶解冻干株，移入增菌液中增菌，转种于平板。

1.3.2金黄色葡萄球菌检测按照GB/T4789.10-2003进行，对样品进行金葡菌检测并计数。

1.3.3DNA模板提取细菌 DNA后，从血平板和Baird-Parker平板上挑取可疑菌落，加入灭菌纯水，100℃煮沸10分钟，离心，取上清液。余标准菌株模板制备方法同上。

1.3.4PCR检测分别对SEA、SEB、SECs基因进行PCR扩增。以DL2000maker为标准，制备琼脂糖，取PCR扩增产物，电泳30 min，观察电泳结果。

2结果

2.1染色镜检、血浆凝固酶试验和菌落计数实验标本进行染色镜检，结果为革兰阳性金黄色葡萄球菌，血浆凝固酶试验阳性，菌落为8.5×107cfu/g。

2.2PCR试验实验标本增出SEA、SEB、SECs基因。对照菌株未扩增出相应片段。

3讨论

典型的金葡菌为球形，无鞭毛，大多无荚膜，不能运动，金葡菌在普通的培养基上可良好生长，为兼性厌氧菌，有很强的环境适应性，金葡菌肠毒素耐热并且不受胰白酶的影响，在70℃水中1 h不能被杀死，在-10~15℃中不能被冻死，需要在100℃加热2 h才能将其破坏。蔗糖或者含盐丰富的食品才可抑制其生长[2]。金葡菌可分解葡萄糖、乳糖、蔗糖等有机物质，部分菌种可水解尿素，还原硝酸盐。金葡菌在环境中均可找到，在人体主要寄殖于鼻黏膜、腹股沟等部位，偶寄生于口咽部、肠道，人群为该病原菌的携带者。金葡菌肠毒素引起食物中毒的特征是潜伏期短。学者认为金葡菌肠毒素作用于胃肠道神经细胞受体，达中枢神经系统刺激呕吐中枢，还可通过T细胞、巨噬细胞等细胞因子导致呕吐和腹泻。此外T细胞被激活后，人体早期体液免疫IgM蛋白的合成受到抑制，加以巨噬细胞清除功能被抑制，细菌大量产生内毒素，引起休克、心肌细胞、肝细胞坏死[3]。

因金葡菌产生的毒素和酶最多，分泌多种毒性蛋白质，毒力强，是食品安全检测卫生中的重要检测项目。这些毒性物质中最主要的一种是葡萄球菌肠毒素，肠毒素是导致暴发性食物中毒的致病因子，人食入含1~20 μg肠毒素的食品就可致病。温度适宜时，金葡菌在6~12 h大量繁殖产生肠毒素，污染食品引起食物中毒。

金葡菌的检测手段主要有显色培养基培养、金葡菌快速测试方法、免疫学方法等。对于金葡菌肠毒素检查，传统采取动物实验中，因非肠毒素类产物也可致幼猫呕吐，特异性不高，很少使用[4]。金葡菌的富集培养，要使金葡菌数量达到一定可检测水平，才能进行金葡菌的分离，形态学观察、理化鉴定，但结果只能定性不能定量。其他检测金葡菌肠毒素的手段有免疫双扩法、反向间接血凝法 、固相放射免疫技术及酶联免疫吸附等。目前分子生物学检测技术高速发展，如核酸探针、聚合酶链式反应、基因芯片技术也广泛开展。聚合酶链反应(PCR)敏感性、特异性高，用于检测金葡菌肠毒素的产毒基因[5]。

参考文献：

[1]陈蕾,贾伟平,陆俊莤,等.上海市金黄色葡萄球菌流行调查[J].中华感染病杂志,2013,31(12):909-912.

[2]张文治.新编食品微生物学[M].北京:中国轻工出版社,2014.

[3]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T4789-2003.中国标准书号[S].北京：中国标准出版社，2004.

[4]张蓓,沈立松.实时荧光定量PCR的研究进展及其应用[J].国外医学临床生物化学与检验册,2012,24(6):327-328.

[5]雷祚荣.葡萄球菌和葡萄球菌毒素病[M].北京:中国科学技术出版社,2012.

[责任编校：张亚光]

[中图分类号]R 155.3

[文献标识码]B

[文章编号]1008-9276(2015)06-0753-02

作者简介：王书冉 (1971-)，女，河南省新郑市人，本科，主管检验师，从事卫生检验与微生物检验工作。

收稿日期：2015-03-18