灵芝孢子粉抗肿瘤活性的研究进展

王卫霄 吕艳茹 姚苗苗 张晓静 杜晓欣 赵素芬

灵芝［Ganoderma Lucidum(Fr.)Karst］是一种珍贵的药用真菌，属于担子菌门(Basidiomycota)担子菌纲(Basidiomycetes)多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属(Ganoderma)，又称“灵芝草”、“仙草”、”长生草”，在我国有悠久的药用历史［1］。传统中医视之为名贵滋补类药材，有扶正固本、延年益寿之功效。灵芝孢子(Ganoderma lucidum spore)是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来极其细小的种子，为灵芝的生殖细胞，是灵芝的精华部分，具有灵芝的全部遗传活性物质，主要有效成分除多糖类、三萜类、肽类，还富含多种氨基酸、寡糖、脂肪酸以及微量元素。灵芝孢子是灵芝的一种繁殖结构，具有坚韧的外壁，破壁后更有利于机体的吸收，其中含有比灵芝更丰富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白质、酶类、硒元素等特殊成份，其药理作用主要有抗肿瘤［2－4］，抗炎、保肝、降血清胆固醇、降血糖、抗辐射、增强免疫功能［5］，抗病毒作用［6］，并对神经、心血管和呼吸系统有调节改善作用。有研究表明灵芝孢子粉可增强免疫功能，并对多种移植性动物肿瘤有明显的抑制作用［7，8］。近年来，对灵芝孢子粉的抗肿瘤研究和利用越来越受到国内外学者的重视，尤其在加拿大、美国以及亚洲国家如中国、韩国、日本对其有较为深入的研究。本文对灵芝孢子在肿瘤治疗方面的研究进展进行综述。

1 灵芝及灵芝孢子的结构及生物学性状

我国现有灵芝属真菌66种，分布于我国多达23个省市，多为野生，主要有灵芝(Ganoderma lucidum)(又名红芝、赤芝)，紫芝(G.Japonicum)即中国灵芝，薄盖灵芝(G.Capense)，树舌芝(G.Applana2tum)，云芝(G.Polystictus)等。其中以灵芝和紫芝药用价值最高，被视为珍贵的中药材。在《中华人民共和国药典》上收入作为药材灵芝来源的是赤芝［Ganoderma lucidum(Leys.exFr.)Karst］或紫芝［Ganoderma japonicum(Fr.)Lloyd］［9］。目前国家卫生部已批准灵芝为食品新资源;《美国草药药典与治疗概要》也收载了灵芝。

灵芝孢子是灵芝的种子细胞呈褐色卵形，大小为(8.5～11.2)μm ×(5.2～6.9)μm(1～2)μm，细胞壁是极其坚固的双层结构骨架，褐色内层壁上有许多针状小突起伸入透明光滑的孢子壁外层［10］。

灵芝孢子内含有比灵芝更丰富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白质、酶、三萜类、有机锗、微量元素等成分［11］，其所含有的灵芝多糖、灵芝酸、有机锗、有机硒等营养物质是灵芝子实体的数十倍，并且其在增强机体免疫功能和抑制肿瘤的药效方面远远超过其母体灵芝［7，12－14］。

2 灵芝孢子的破壁

组成灵芝孢子细胞壁的物质为几丁质和肽聚糖(PePtdoglycan)，由于聚糖链上所存在的肽键数量多，交联程度紧密致使结构十分致密，导致强度很高，质地坚硬，且耐酸碱。灵芝孢子粉的活性部位主要在壁内，服用未破壁的灵芝孢子后必须依靠胃酸和人体的生物酶的作用，将细胞壁溶解后，孢子细胞内的营养物质才能被人体所吸收。因为孢子细胞在人体内停留时间有限，限制了人们对孢子内有效物质的消化吸收，极易造成孢子细胞的浪费;同时也限制了对其化学成分及生物活性成分的研究。为利于孢子细胞内营养物质在人体内快速释放而达到充分利用灵芝孢子内的有效物质以提高药效的目的，须对灵芝孢子进行破壁处理，破壁处理后的孢子壁则残缺不全，内容物呈不规则团块状。

采用物理手段及一般的化学方法很难破坏灵芝孢子的双层壁，有效的灵芝孢子破壁方法可以促进其生物活性成分的提取及药用价值的研究。常用的破壁方法有酶法、振动磨法和超微粉碎法［15］，过冷液氮淬冷法［16，17］，低温玻璃化破碎法［17］等。李淑芳等［18］利用萌发破壁法、超微粉碎法、酶解法这三种方法的综合法破壁，取得满意的破壁率。洪亮［19］采用超音速气流破壁法破壁可使灵芝孢子粉破壁率达到98%以上，该法破壁的灵芝孢子醇提物及水提取物的抗氧化活性比未破壁者明显升高。破壁后醇提取物的DPPH(1，1-二苯基苦基苯肼)、ABTS(2，2’-偶氮-双(3-乙苯基-噻唑啉-6-硫酸)和羟自由基清除率的EC50较未破壁灵芝孢子粉分别低 46.53%、77.11% 和 69.51%，FRAP 值和ORAC值分别高出287.87%和30.18%。倪江洪等［20］的研究中破壁孢子提取液的多糖含量明显高于不破壁孢子，而且破壁孢子中多糖更容易提取。鲍幸峰［21］等研究了破壁前后灵芝孢子粉多糖的提取，提示在37℃、沸水浴及水煮条件下，破壁比未破壁孢子的多糖释放能力分别强118.4%、87.5%和69.6%。

3 灵芝孢子的生物活性物质及其抗癌活性

灵芝所含化学成分复杂，目前已知的有糖类(还原糖和多糖)、氨基酸、蛋白质、多肽、甾类、三萜类、挥发油、香豆精苷、生物碱、树脂、油脂、多种酶类、微量元素等。包括了人体所必须的营养物质，同时还是人体健康所必需的膳食纤维的很好来源。

灵芝的有效化学成分一直是人们关注的焦点。现已知灵芝多糖类化合物和灵芝三萜类化合物是灵芝的关键药效成分［22］。其成分分为醇溶性和水溶性两种，醇溶性物质为灵芝孢子油，其中脂肪酸占70%左右(大部分是不饱和脂肪酸)，三萜类物质占20%左右;水溶性物质主要为灵芝多糖类化合物。

3.1 灵芝孢子粉多糖 灵芝孢子粉多糖(Ganoderma Lucidum spore polysaccharide)是灵芝孢子粉的主要有效成分，是灵芝孢子重要药理活性的体现者，具有多种药理学活性。灵芝孢子粉多糖的相对分子质量在50 000以上，主要以 β-葡聚糖为主［12，23］。此外，还有甘露葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖、肽多糖、杂多糖、半乳葡聚糖等。

灵芝多糖具有抗肿瘤及提高肌体免疫活性的功能［24，25］，是灵芝具有扶正固本的主要有效成分。灵芝多糖的抗肿瘤作用最初发现于移植性肉瘤小鼠的腹水中［26］。多糖的化学结构与其生物活性功能关系密切，当多糖的分子量＞1×104时才显示出强的抑制肿瘤的活性，且α-葡聚糖和β-葡聚糖的抗癌功能也有区别，α型结构多无活性［27］，其在主链上的取代度和侧链长度(且活性强弱与多糖链支的程度及支链上羟基取代的数量)是决定水溶液中的构象和β-D-(1-3)葡聚糖具有生物活性的非常重要的因素［28，29］。灵芝多糖的抗癌活性是通过与β-葡聚糖结合的补体受体3(CR3)介导的［30］。倪惠芳等［31］试验，2 组小鼠分别先服灵芝多糖和蒸馏水，然后在其足趾上接种肺癌细胞和结肠癌细胞，再连续给服灵芝多糖和蒸馏水，连续服10 d，结果服灵芝多糖鼠足趾肺癌细胞瘤重为0.52 g，肠癌细胞瘤重为0.475 g，而对照组瘤重分别为1.21 g和0.945 g，灵芝多糖对肿瘤的抑制率达50%以上。进一步分析发现服过灵芝多糖的小鼠血清中含有丰富的肿瘤免疫因子如白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和干扰素(rIFN)，表明灵芝多糖是通过提高机体肿瘤免疫因子抑制肿瘤生长。李建军等［8］给Balb/c小鼠皮下接种 S-180肉瘤后，灵芝提取物(GLE)5、10、20 g(生药)/kg 及灵芝多糖灌胃，共10 d，可显著抑制 S-180肉瘤生长，其抑瘤率分别为22.77%、41.58%和 60.89%。灵芝多糖与环磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)并用还能增强后者的抗肿瘤作用。

灵芝多糖可以通过刺激自然杀伤细胞、T细胞、B细胞及巨噬细胞的免疫应答而激活宿主的免疫反应而抑制了肿瘤的形成和转移［32］。灵芝多糖具有化学预防作用，这种作用是通过诱导谷胱甘肽转移酶(GST)的活性来调节的［33］。有研究发现灵芝的不同部位提取出来的灵芝多糖的抗肿瘤活性也不相同［34］。

3.2 三萜类化合物 三萜类化合物是灵芝中另一类主要的有效成分，是灵芝药用功效的主要物质基础之一［35］，其化学结构为高度氧化的羊毛甾烷衍生物，具有较高的脂溶性，分子量一般为400～600。三萜类化合物化学结构较复杂，目前已知有7种不同的母核结构，在母核上有多个不同的取代基，常见有羧基、羟基、酮基、甲基、乙酰基和甲氧基等。由于灵芝三萜类成分化学结构的多样性，并且其种类多，化学结构多样，因此其具有较广泛的药理作用［36，37］，如保肝、抗肿瘤、抗微生物、抗高血压;抗HIV-1及HIV-l蛋白酶活性;抑制组胺释放;抑制血管紧张素转化酶;抑制血小板聚集;抗氧化等重要作用［38］。

三萜类萜烯酸是其主要苦味成分［39］，如灵芝酸(gandenic acid)A、B、C、D、E、G、I、L、α、DM、ma、mb、mc、md、mg;赤芝酸(lucidunic acid)A、B、C、D、E、F、O;tsugaric acid A、B。首次分离到三萜类化合物的主要成分灵芝酸A(ganodericacid A)和灵芝酸B(ganodericacidB)是于1982 年由 Kubota等［39］完成的，之后相继有新的三萜类化合物自灵芝孢子分离得到［6，40］，目前各种灵芝中分离到的三萜类化合物已达100多种。Tothjo等［41］首次报道了灵芝三萜类化合物的药理活性，利用提取得到的6种有细胞毒活性的三萜类化合物ganodericacid U、V、W、X、Y 和 Z进行体外实验，结果表明三萜类化合物能明显抑制小鼠肝肉瘤(HTC)细胞的增殖。Lin等［42］分离到灵芝醛A和双氢灵芝醛A，体外实验表明两者有较强的抑瘤活性，对人肝肉瘤细胞和KB细胞ED50值均在1～11 μg/ml，并且以灵芝醛A作用最强。Kimura等［43］的研究表明三萜成份ganoderic acid F在100～200 mg/kg能抑制脾脏的实体瘤生长，并且能明显抑制肿瘤细胞转移;当三萜成份达到800 μg/ml，可抑制肿瘤血管生成。灵芝酸可以通过阻断人肝瘤细胞株BEL7402细胞周期G1期向S期转变，使细胞周期停滞从而抑制癌细胞的生长，在浓度 500 μg/ml时，其抑制率可以达到70%［44］。灵芝三萜可以诱导HeLa细胞G0-G1期停滞，蛋白质组学研究显示它可以导致蛋白质14的可调节型表达，蛋白质14对细胞增殖，细胞周期、凋亡和氧化应激起着重要的作用［45］。灵芝三萜对多种肿瘤细胞的生长和转移都有抑制作用。自南方灵芝(Ganoderma australe)分离出的 applanoxidic acid A、C、F和G可以抑制人早幼粒白血病细胞系(HL-60 cell line)的生长与增殖［46］。

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