C6细胞培养上清液的收集及其乳酸含量变化和意义①

高丹丹，刘君星，辛 华，李雅江，王 琳

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)



C6细胞培养上清液的收集及其乳酸含量变化和意义①

高丹丹1，刘君星2，辛 华1，李雅江1，王 琳1

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：验证胶质瘤细胞可能的一种乳酸快速排泌机制。方法：C6按6组不同浓度(0.5×105；0.75×105；1×105；1.25×105；1.5×105；2×105)接种，24h收集上清液，检测乳酸，乳酸脱氢酶含量，以海马神经元HT22作为对照。结果：接种浓度为1×105个/L组细胞24h密度适中处于指数增生期，乳酸和乳酸脱氢酶含量高于其他组(P<0.01)(除1.25×105个/L浓度组)。C6细胞培养上清液中乳酸含量明显高于HT22细胞培养上清液(P<0.01)。 结论：胶质瘤细胞可能有一种快速排泌机制，使得其代谢产生的大量乳酸在细胞外液中堆积。

脑胶质瘤;细胞培养;乳酸;乳酸脱氢酶

细胞活性与其能量状态紧密相关，肿瘤细胞的恶性增值是一种能量消耗过程，常有摄入胞内的葡萄糖量增高、糖酵解活性提高的现象[1]。然而肿瘤是一类异质性疾病，每一种肿瘤都有自己的代谢特点，都需要严谨的实验去验证。正常人脑脊液乳酸(CSF-LA)含量很低，有报道乳酸在恶性胶质瘤中[2]升高。然而邵巍等[3]研究发现高恶性程度的脑胶质瘤细胞中乳酸盐(lactate)等代谢物较良性脑胶质瘤细胞有下降趋势。分析其原因可能是胶质瘤细胞有一种快速排泌机制，以保证乳酸不能在细胞内大量堆积而影响其生长。因此如果能检测细胞外液(细胞培养上清液)便有可能更好的解释这一现象。对于这些排泌出的LA，脑脊液的检测是一种选择，脑脊液中LA浓度主要反映了中枢神经系统糖酵解代谢的状况，而不依赖于血清LA浓度。然而，脑脊液的样本收集具有创伤性。目前关于细胞外液的收集报道很少，本实验通过检测C6不同细胞浓度上清液中葡萄糖和乳酸脱氢酶及乳酸的含量，找到一种能稳定收集细胞外液中乳酸的细胞培养方法[4～6]。并用此方法检测c6和HT22细胞培养上清液中乳酸的含量，分析其意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

主要仪器：超净台工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，日立7060全自动生化分析仪。 药品：培养基(DMEM)、胎牛血购自GIBCO公司，乳酸、乳酸脱氢检测试剂盒购自北京北检新创源技术有限公司，乳酸脱氢酶检测使用终点法，乳酸使用酶显色法。细胞系：脑胶质瘤细胞C6购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，海马神经元HT22购自广州吉妮欧生物科技有限公司。

1.2 方法

购买的C6细胞传代3次后，以6组不同浓度(0.5×105；0.75×105；1×105；1.25×105；1.5×105；2×105)接种于培养瓶，培养箱条件为相对湿度95%,O295%,CO25%，37℃恒温每组浓度5个平衡样，于24h观察细胞状态，把原有培养基吸出至离心管中1000转/分离心5min吸取上清液至细胞冻存管，冰袋运送至检测实验室，使用日立7060检测乳酸，乳酸脱氢酶。选出最适合的接种浓度后以此浓度接种2种细胞，C6作为实验组，HT22作为对照组，相同条件下培养24h，收集上清液测乳酸含量。试剂购自北京北检新创源技术有限公司，乳酸脱氢酶检测使用终点法，乳酸使用酶显色法。

1.3 统计学处理

2 结果

当接种浓度≤1.25×105个/mL时随着细胞接种浓度的升高，细胞培养上清液LA、LDH的含量逐步升高，在接种细胞浓度1.25×105个/mL到达最高点，LDH含量为( 116±5.71)U/L，LA的含量为(17.76±0.79)mmol/L；当接种细胞的浓度超过1.25×105个/mL时，24h后细胞大量凋亡。接种浓度为1×105个/L组细胞24h密度适中处于指数增生期,LDH含量为 (85±5.25)U/L，LA的含量为(15.48±0.53)mmol/L；我们选择1.00×105个/mL的细胞接种浓度比较HT22与C6在培养24h后细胞培养上清液中LA含量差异，结果显示，C6细胞培养上清液中LA含量为(15.29±0.5)mmol/L,HT22细胞培养上清液中LA含量为(3.51±0.3)mmol/L，二

者差异显著(P<0.01)。说明肿瘤细胞产生了大量的LA，并排泌到细胞外，使得其细胞外液LA含量明显高于正常细胞。

3 讨论

细胞培养传代后要经过三个阶段，潜伏期，指数增生期，停滞期，然后退化死亡，其中细胞潜伏期与细胞接种密度，细胞种类和培养基性质等密切相关[7～11]，肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24h，细胞接种密度大时潜伏期短。根据这一原理及更简化试验操作的目的，选定一个收集细胞上清液的时间即24h，然后通过接种不同浓度的细胞，筛选出符合以下条件的接种密度：①培养24h细胞处于指数增生期，细胞只有处于此期，其糖类代谢最旺盛，产生的乳酸最多最快。②细胞接近长满培养瓶未发生密度抑制(大约106个/瓶)，细胞不是越多越好，当发生了密度抑制即使是指数增生期细胞分裂也会停止。③LA及LDH较高； ④ 结果具有可重复性。我们的实验结果显示随着细胞接种浓度的增加LDH也呈递增趋势，当细胞接种浓度升高超过1.25×105个/mL时，LDH活性开始下降，此时LDH的量可能很多，但某种机制导致其活性下降。LA的变化趋势与LDH相似。接种浓度为1.00×105个/mL和1.25×105个/mL的两组细胞培养24h后均处于指数增生期。1.25×105个/mL组LDH、LA含量最高，与其他组有显著差异(P< 0.01)，但过高的LA会引起细胞损伤，抑制细胞增殖,高LDH含量也提示其细胞已经发生部分损伤。因此，1.00×105个/mL的接种浓度是符合上述筛选条件的实验浓度。

糖代谢是细胞的主要能量来源。葡萄糖在体内经糖酵解和氧化磷酸化两条主要途径氧化分解。糖酵解通过胞膜上的葡萄糖转运体(GLUT)将葡萄糖转运入胞内，通过糖酵解途径生成丙酮酸，这一过程称为“糖酵解”。丙酮酸在缺氧条件下转化成乳酸。早在1927年，就有人发现一些肿瘤细胞的糖代谢存在异常，就是在有氧环境下，肿瘤细胞也会优先进行糖酵解，并产生大量的乳酸，即所谓的“有氧糖酵解”，亦称之为“Warburg效应”。 本实验一方面证实③接种浓度下乳酸生成显著高于对照组，再一次验证了肿瘤细胞繁殖需要大量的ATP，满足其合成RNA和DNA的需要。而肿瘤尤其是实体瘤常存在缺氧的微环境，因此有些肿瘤甚至在氧气充足的情况下亦以无氧酵解为主。同时可能是因为肿瘤细胞生长迅速，也需要大量萄萄糖来提供能量;其次近期一些基因方面的研究，证实某些基因的变异及过量表达诱发一些酶类活性的改变[12～14]。肿瘤细胞导致糖代谢异常的机制目前还未完全明确，目前认为可能的机制有导致糖代谢紊乱的机制可能有[12]:(1)肿瘤异质性:尤其是进展期肿瘤，组织和形态的变异引起生物学特性异质性，(2)异位激素分泌: 神经母细胞瘤等产生异位激素。另一方面本实验测得乳酸值来源于细胞培养上清液(单一的肿瘤细胞沐浴的环境)，其乳酸值升高完全反应肿瘤细胞的代谢变化，我们的实验结果显示脑胶质瘤C6细胞在增殖过程中在细胞液中产生大量LA的同时，说明C6细胞进行糖酵解产生了大量的LA，与正常的HTT22细胞相比差异显著。因此我们的实验很好的解释并证实了高恶性程度的脑胶质瘤细胞中乳酸盐(lactate)等代谢物较良性脑胶质瘤细胞有下降趋势，分析其原因可能是胶质瘤细胞有一种快速排泌机制。

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The collection of extracellular fluid of C6cell culture and the significance of lactic acid content content

GAODan-dan1，LIUJun-xing2,XINhua1,LIYa-jiang1,WANGLin1

(1.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China;2.School of Basic Medical Science Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Objective: To validate the quick exhaust urinary mechanism of lactic acid glioma cell. Methods: C6cells were inoculated according to different concentrations in 6 groups(0.5×105；0.75×105；1×105；1.25×105；1.5×105；2×105). The supernatant was collected after 24 hours. The contents of lactic acid and lactate dehydrogenase were determinated with hippocampal neurons HT22 as control. Results:The number of cells is moderate and cells grow at an exponential rate in the group of 1×105/L inoculation concentration after 24h. Lactic acid and lactate dehydrogenase were higher than those in other groups (P<0.01) (exceptfor1.25×105concentrationgroup).LacticacidcontentofC6cellculturesupernatantwassignificantlyhigherthanthatinHT22cell(P<0.01).Conclusion：Glioma cells may have a rapid excretion mechanism. The accumulation of large amounts of lactic acid makes the metabolized in the extracellular fluid.

glioma; cell culture; lactic acid; lactic acid dehydrogenase

佳木斯大学研究生科技创新面上项目，编号：LM2014-023； 黑龙江省卫生厅项目，编号：2011-401。

高丹丹(1982～)女，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。

王琳(1974～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，副主任技师，硕士研究生导师。E-mail: wanglin4477@163.com。

文献标识码： 文章编号：1008-0104(2015)03-0044-02

2014-10-19)