非小细胞肺癌靶向基因研究新进展

郭永军

(郑州大学附属肿瘤医院 分子病理科 河南 郑州 450008)

30年来，我国肺癌死亡率增长465%，肺癌在全部因癌症死亡患者中占22.7%，其中85%是非小细胞肺癌，肺癌已成为我国因癌症死亡患者的第一杀手，严重威胁人民群众的生命健康。随着分子生物学的发展，基因改变的检测及相应靶向药物的研发使得肺癌的治疗水平得到极大提高。基因检测继以靶向药物治疗标志着肺癌进入个体化治疗的时代，大大延长了肺癌患者的生存期。近年来基因检测日益常规化，本文以EGFR 和ALK 为例综述非小细胞肺癌靶向基因研究的新进展及技术革新对基因检测的改变，以利于相关临床医师和基础研究人员了解相关研究进展。

1 EGFR 研究现状

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是ErbB 家族成员之一，与配体结合后，EGFR 同源或异源二聚体聚集，激活PI3K/AKT 和RAS/RAF/MAPK 细胞信号通路。在非小细胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCLC)中，EGFR 突变集中在18 ～21 外显子，其中19 和21 外显子突变最为常见，突变可导致受体酪氨酸激酶结构域异常活化，引起细胞向恶性转化。NSCLC 中EGFR 突变率在北美和西欧人群中为10%左右，而在东亚人群中为30% ～50%，其中在亚裔、女性、非吸烟、腺癌患者中EGFR 突变率甚至高达70% ～80%［1］。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR－TKIs)广泛用于治疗晚期NSCLC，其疗效已经得到广泛认可。

2005年吉非替尼(易瑞沙)进入中国市场，10年来在政府和公司的大力推动下，EGFR 突变检测逐渐普及，到2014年我国已有超过100 家医院建立EGFR 突变的院内检测平台，为肺癌个体化治疗和临床研究提供了保障。在此背景之下，EGFR 的研究开始走向更多功能的研究和更灵敏检测方法的研发。

1.1 EGFR 在肿瘤异质性中研究 许多研究者提出了原发灶和转移灶EGFR 突变异质性的假设，并进行了多项研究［2］。Gow 等［3］研究67 例NSCLC 患者的原发灶和转移灶EGFR 的突变情况发现，原发灶EGFR 突变呈阳性的患者中有50%(9/18)在转移灶中突变丢失，转移灶EGFR 突变呈阳性的患者中有65%(17/26)在原发灶是阴性的。利用扩增阻滞突变系统法检测，发现该样本EGFR 异质性达到27%(18/67)。我们团队用EGFR 定量的方法检测原发与转移灶之间的突变发生率的关系，50 例NSCLC 患者中相符率为84%，16%患者在原发灶中检测到10%以上的EGFR 突变，而在转移灶中并未检测到［4］。利用EGFR 突变状态研究肿瘤异质性，其结果表明肿瘤状态是繁杂而充满变化的，这令我们对单次检测EGFR 状态而指导临床靶向用药的合理性提出质疑。

1.2 EGFR T790M 突变研究 目前存在争议的是T790M 突变是原发的，还是EGFR－TKIs 治疗后新出现的。大多数研究是在EGFR－TKIs 出现耐药的患者中发现T790M 突变，认为T790M 突变是EGFR－TKIs 治疗导致的［5］，但后来在未经任何治疗的患者标本中也发现T790M 突变。因此，有学者提出T790M 突变原发存在，由于这些细胞抵抗EGFR－TKIs，治疗后以优势细胞群体显现出来［6］。此外，在耐药患者样本中还相继发现了D761Y、L747S、T854A 等突变［7－9］，这些突变均可能参与耐药，被称为“非T790M 继发突变”。

1.3 EGFR 突变亚型研究 EGFR 中最常见改变是19外显子缺失及21 外显子L858R 突变。我们研究发现，19外显子缺失相对21 外显子突变在女性患者中突变率更高［10］。Li 等［11］研究显示，21 外显子突变的肺癌恶性程度可能更高，19 外显子缺失以左肺居多，而21 外显子突变多发生在右肺。但是国内其他研究却显示，19 外显子缺失以右肺原发更常见［12］。目前，是否可将二者区别对待仍存在争论。Riely 等［13］通过对34 例肺癌患者应用EGFR－TKIs 治疗发现，21 外显子突变患者无进展生存时间(progression－free survival，PFS)及总生存期(overall survival，OS)明显低于19 外显子突变患者。Mitsudomi等［14］报道，相比其他EGFR 突变类型肺癌患者而言，EGFR19 外显子缺失肺癌患者对吉非替尼的反应率更高。Zhu 等［15］从细胞水平分析了EGFR19 外显子缺失突变和21 外显子点突变对吉非替尼反应性不同的原因，发现吉非替尼均能导致EGFR19 外显子缺失突变和EGFR21 外显子点突变的稳定转染细胞EGFR、Akt 和Erk 分子磷酸化受到抑制，但对前者的抑制较后者更明显。而与21 外显子点突变的细胞比较，吉非替尼能导致更多的19 外显子缺失的细胞G1 期阻滞。

1.4 基于EGFR 状态的靶向联合化疗临床研究 EGFRTKIs 在EGFR 基因突变的晚期NSCLC 患者一线、二线、维持治疗等领域中都不逊色于传统化疗，靶向治疗的应用不仅仅局限于单纯靶向治疗，还拓展至靶向联合化疗。

日本一项关于NSCLC 患者吉非替尼术后辅助化疗的回顾性研究结果显示，EGFR 基因突变患者比野生型患者的中位OS 显著延长(930 d vs 210 d，P ＜0.01)。但是回顾性研究并不能成为可靠证据，仍需更多前瞻性研究予以证实。2013年ASCO 上一项中国启动的Ⅱ期随机临床试验表明，针对EGFR 突变型的术后ⅢA 期NSCLC 患者，以EGFR基因状态为前提，进行带或不带吉非替尼的培美曲塞联合卡铂辅助治疗，尽管靶向治疗组的OS 绝对值延长，但差异无统计学意义。

我国NCT01410214 和NCT01683175 两项临床研究均为厄洛替尼辅以长春瑞滨联合顺铂治疗ⅢA 期NSCLC 切除术后EGFR 基因19 外显子或21 外显子突变患者，以2年DFS作为主要研究终点。广东临床试验协会NCT01405079 项目是2011年启动的一项为期8年的Ⅲ期临床试验，以吉非替尼联合长春瑞滨或顺铂治疗EGFR 基因发生突变的Ⅱ～ⅢA(N1 ～N2)期NSCLC 者。

目前支持早期NSCLC 术后辅助EGFR－TKIs 治疗能有效延长DFS 和OS 的循证医学证据并不充分，在EGFR基因突变状态的基础上，需要更多的前瞻性、多中心、随机、与标准化疗方案对照的临床试验数据支撑。

1.5 EGFR 新技术检测 随着数字PCR(Digital PCR)技术的日益成熟，由于其灵敏度较高，研究者将目光逐渐转向血循环中的微量基因的检测。Zhang 等［16］比较了ARMS－qPCR 方法和数字PCR 的检测灵敏度。ARMS－qPCR 方法检测到1% ～5%的突变频率，而数字PCR 则可以检测到低至0.1% 的突变，同时还检测出1 例经ARMS－qPCR 方法未检出的T790M 突变(7/6 000)，显示出数字PCR 在检测稀有突变中的优势。数字PCR 甚至可以将灵敏度提升到0.04%［17］。由于血液检测属于无创、动态检测，对于术后及难以取到样本的患者而言将具有很大的临床使用价值，该技术在经过数据验证之后将有可能在未来逐渐应用用于临床检测。

2 ALK 融合基因研究现状

间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)基因是胰岛素受体超家族的成员，20年前首次以NPM－ALK 融合基因的形式在间变性大细胞淋巴瘤中被发现［18］，2007年Soda 等［19］在75 例NSCLC 患者中发现5例携带棘皮动物微管相关蛋白样4(echinoderm microtubule－associated protein－like 4，EML4)ALK 融合突变基因，并且发现EML4－ALK 融合基因有致瘤性。EML4 与ALK 基因都位于2 号染色体短臂上，由于其中1 个基因倒置而产生EML4－ALK 融合基因。相关研究已经证实，EML4－ALK 可通过丝裂原活化蛋白激酶－分裂原活化蛋白激酶－细胞外调节蛋白激酶、磷脂酰肌醇3－激酶－蛋白激酶B 和ras 信号传导及转录激活因子－3 信号通路促进肿瘤细胞的增殖、分化、抗凋亡［20］。ALK 是NSCLC 的关键启动癌基因，虽然只有5%的NSCLC 患者出现ALK 基因融合［21］，但由于具有明确的分子靶点，确诊ALK 基因融合将会使患者从靶向药物治疗中获益［22］。

2.1 ALK 基因融合检测技术 目前荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)是美国FDA 唯一批准的检测ALK 基因融合的方法［23］，是检测EML4－ALK融合基因的金标准。免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)是一种经济简便的诊断方法，其敏感性低于FISH 法，可用作FISH 法前对EML4－ALK 融合基因的预筛查。研究表明，使用单克隆抗体能提高IHC 法检测的敏感性和特异性［24］。Fukuyoshi 等［25］利用RT－PCR 分别检测了104 例肺癌，仅1 例肺癌标本中发现了EML4－ALK 的mRNA，显示PCR 方法检测ALK 融合基因仍需优化。高通量测序的确可以发现未知的融合类型，但是目前测序成本太昂贵，令其不太适合在临床上应用。2014年Zheng 等［26］使用新型锚定多重PCR(anchored multiplex PCR)，通过引物设计和高通量测序对986 例患者石蜡样本进行检测，在不同肿瘤中发现了9 种新的融合基因，展现出其检测未知融合基因的强大能力。

2.2 ALK 耐药研究 克唑替尼治疗ALK 阳性的NSCLC患者常常在1 a 内出现药物抵抗，并发生中枢神经系统转移，可能与克唑替尼在脑脊液中的浓度远低于血浆有关［27］。关于耐药机制研究，体外实验显示不同ALK 融合类型对药物的敏感性不同，显示可能存在不同原发融合类型导致耐药的出现［28］。但是临床实验结果却不支持这一观点［29］。耐药机制可能涉及到基因突变和基因扩增，其中突变代表是L1196M 突变，类似于T790M 突变，L1196M 突变导致构象变化、激酶活性增加，继而导致耐药。其他耐药突变还有G1269A、C1156Y、L1152R、G1202R、S1206Y、1151Tins、F1174C、D1203N［30］。

2.3 新药开发 针对克唑替尼的耐药现象，制药企业也在加快新药的研发。FDA 2011年快速批准克唑替尼上市，2014年又批准了第2 代靶向药物色瑞替尼(Ceritinib)用于克唑替尼不耐受的ALK 阳性患者［31］。目前，针对ALK－L1196M 和EGFR－T790M 双突变的口服TKI AP26113［32］和 针 对ALK－L1196M 及C1156Y 突 变 的CH5424802［33］均在临床实验中。另一类新药是HSP90 抑制剂，作为分子伴侣抑制剂，通过稳定和调节ALK 蛋白，加快其蛋白降解从而达到治疗效果［34］。目前HSP90 抑制剂类新药如Ganetespib［35］、Onalespib［36］、IPI－504［37］等均处于研发中。

3 结语

我国正处于社会高速发展阶段，老龄化进程、空气污染、环境污染、社会压力、吸烟习惯等导致肺癌高发，这已经成为非常严峻的社会问题。从全国来看，基因检测率只有27%，与日本、韩国以及香港、台湾地区超过80%的检测率差距较大，我国基因检测普及亟待进一步加强。我国与国外相比在基因基础研究方面仍存在不小差距;在临床研究方面基本处于国际先进水平，但仍需研究成果来奠定国际地位;在新药研发方面与国外相比显示出巨大差距，我国新药研发将任重道远。最后应该关注新技术在基因检测领域带来的变化，高通量测序、液体活检、大数据分析、数字PCR 等新技术新理念可能在未来给该领域带来革命式的改变。

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