细菌培养法与PCR法对细菌性阴道炎辅助诊断的价值

邓石雄，刘映云

(增城市人民医院检验科，广东 增城 511300)

细菌培养法与PCR法对细菌性阴道炎辅助诊断的价值

邓石雄，刘映云

(增城市人民医院检验科，广东 增城 511300)

目的 比较细菌培养法与PCR法诊断细菌性阴道炎的价值。方法选择我院2012年10月至2014年10月收治的208例细菌性阴道炎患者，采集阴道分泌物后，分别用PCR法与细菌培养法鉴别细菌种类，比较两种方法的灵敏度、特异性。结果检出的致病菌种以阴道加德纳菌最常见，占61.8%。PCR法检出阳性率为81.7%，明显高于细菌培养法的65.4%，且PCR法检灵敏度为98.2%，特异性为95.3%，均明显高于细菌培养法的85.6%与86.6%，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论PCR法较细菌培养法对细菌性阴道炎具有更好的诊断价值，值得临床推广应用。

细菌培养；PCR；阴道细菌；检验

细菌性阴道炎为育龄妇女常见的临床疾病，患者以生殖道微生物菌群变迁为基本特征[1]，起病缓慢，患者多无自觉症状，有临床症状时往往感染较重，可导致盆腔及腹部感染，甚至可能导致患者丧失生育能力[2]。早期诊断、早期治疗为获得满意预后的关键所在。目前临床常用的检测细菌性阴道炎的方法包括阴道分泌物检查、分离培养法、PCR法、免疫荧光法等[3-5]。本研究为探讨细菌性阴道炎有效的临床检测方法，选择我院2012年10月至2014年10月收治的208例患者，于阴道后穹窿采集阴道分泌物后同时采用PCR法检测阴道菌群，与细菌培养法检测相关的致病菌相比较，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择我院收治的300例有外阴瘙痒、阴道分泌物增多、异味、阴道炎患者为研究对象，300例患者经培养法检查排除真菌性阴道炎患者，共计208例细菌性阴道炎患者。符合《妇产科学》中关于细菌性阴道炎的诊断标准，即：(1)阴道分泌物呈灰白色、黏稠、面糊状，均匀一致；(2)分泌物呈鱼腥味，性交时或活动后加重；(3)阴道分泌物的湿涂片中可检出经线索细胞；(4)阴道分泌物中的pH值增高，pH范围5.0～5.5。上述四项中，具备三项以上者即可确诊。患者年龄20～42岁，平均(32.6±3.9)岁。采用无菌棉签于阴道后穹窿处蘸取阴道分泌物，置于无菌盐水中保存，分别用细菌培养法及PCR法检测细菌类别。

1.2 仪器与试剂 血琼脂平皿、巧克力平皿、中国蓝平皿、阴道加德纳菌专用分离培养基购自杭州微生物试剂有限公司，标准金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、大肠埃希菌(ATCC25922)均购自卫生部生物制品鉴定所。全自动微生物鉴定仪为西门子诊断公司的MicroScan Walk Away96型。PCR仪为BioRad CFX96型，PCR所用试剂购自康为试剂有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 细菌培养法 取阴道分泌物在固体琼脂平板、斜面培养基、半固体琼脂培养基上行连续平行分区划线法、连续蛇形划线法、穿刺法接种，接种后置于二氧化碳培养箱中培养48 h，待长出菌落后置于全自动微生物鉴定仪鉴定细菌种类。

1.3.2 PCR法 将含1 000µl混有生理盐水的阴道分泌物于1 200 r/min，离心15 min。离心后弃去上清液，向沉淀中加入组织裂解液，置于60℃水浴锅孵育10～15 min后取出，然后以1 200 r/min离心10 min，取上清液为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：双蒸馏水53.5µl，10×反应缓冲液10.0µl，4×dNTPs(各1.25mmol/L)16.0µl，DNA模板10.0µl，引物(引物设计参考文献[6-8]，由上海博亚生物技术有限公司协助合成)。Taq聚合酶0.5µl，总体积100µl。加入反应体系后置于PCR仪上，以反应条件：94℃60 s，37℃60 s，72℃120 s，共25～30个循环，结束后采用琼脂糖凝胶电泳观察结果。阳性对照与阴性对照除不加模板DNA外，其余同检测组。

1.4 判定标准 细菌培养阳性标准：培养基上长出典型菌落，经生化鉴定为目的菌落即为阳性[9]。PCR阳性标准：条带宽度不超过1mm，边缘整齐，条带在预期的碱基大小范围内，背景上无药斑(Smears)也无引物二聚体出现，出现预期碱基大小之外的其他条带为人工假阳性[10]。

1.5 统计学方法 所有数据均应用SPSS20.0统计学软件进行分析，计量资料以以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，计数资料以百分率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法阳性率比较 细菌培养法检出阳性136例，阳性率为65.4%。PCR检出阳性170例，阳性率为81.7%。PCR检出阳性率明显高于细菌培养法，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 两种方法检测阳性菌分布情况比较 细菌培养法检出阴道加德纳菌84例(61.8%)，淋球菌27例(19.9%)，肠球菌25例(18.3%)，阴道加德纳菌比例显著高于其他菌株，差异有统计学意义(P＜0.05)。PCR法检出阴道加德纳菌90例(52.9%)，棒状杆菌44例(25.9%)，肠球菌36例(21.2%)，阴道加德纳菌比例明显高于其他菌株，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 两种检测方法的灵敏度、特异性比较 PCR法灵敏度为98.2%，特异性为95.3%。细菌培养法灵敏度为85.6%，特异性为86.6%。PCR法检测灵敏度、特异性均显著高于细菌培养法，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

健康生育期女性阴道中寄生多种细菌，包括共生菌与条件致病菌。临床研究显示[11-12]，导致女性发生阴道感染的常见致病菌群有葡萄球菌、阴道加德纳菌、肠球菌、链球菌、肠杆菌科菌等。通常情况下正常菌群不会致病，妊娠时因内分泌影响导致女性阴道pH值升高，易造成菌群失调，正常菌群可成为致病菌，且随孕周延长，阴道抵抗力下降，易导致各种感染的发生[13]。早期检测致病菌群对于细菌性阴道炎治疗、预后意义重大。目前临床常采用的辅助诊断方法包括：细菌培养法、PCR检测特定基因表达情况从而辅助诊断细菌感染等。临床医师可通过患者主诉，妇科查体及实验室辅助检查诊断阴道细菌性感染。其中阴道分泌物检测对阴道炎等妇科疾病患者临床诊断价值重大，检查结果的准确性与诊断、治疗密切相关[14-15]。

细菌培养法为目前临床最常用的检测方法，曾作为细菌性阴道炎检测的金标准。但由于该方法操作复杂，对实验室要求高，且需3 d以上方可获得结果，而逐渐被新的检测技术PCR所取代。PCR技术是基于DNA的半保留复制的一种基因工程技术，对样本量要求低，检测灵敏度高、特异性好，可于当天获得结果，给临床早期诊断、早期治疗提供了可能。通过对临床常见的致病菌以通用引物进行PCR试验，结合临床症状、体征可于早期诊断细菌性阴道炎。对于有特殊培养要求的细菌，难以培养甚至无法用人工方法培养的细菌，PCR检测提供了一种新的途径与方法，从而减少普通培养阴性导致的漏诊、误诊。

本组研究中比较了细菌培养法与PCR法检测细菌性阴道炎中细菌分布情况，结果显示，PCR法阳性率显著高于细菌培养法，PCR细菌分布以阴道加德纳菌为主，其次为棒状杆菌、肠球菌。细菌培养法细菌分布也是以阴道加德纳菌为主，其次为淋球菌、肠球菌。两种检测方法细菌分布均以阴道加德纳菌为主，其余细菌分布稍有差异。PCR检测灵敏度、特异性均优于细菌培养法，提示其在细菌性阴道炎临床诊断中具有重要价值。PCR法还可检测阴道分泌物中阴道加德纳菌浓度，通过阳性、阴性阴道加德纳菌浓度比较，可确定阴道炎阴道加德纳菌正常参考范围，浓度高于此参考范围可高度怀疑细菌性阴道炎感染，结合临床症状、体征可做出早期诊断，从而利于迅速控制感染，促进患者康复。

综上所述，PCR法检测阳性率显著高于细菌培养法，检测的灵敏性、特异性也较细菌培养法高，基于此我们提出PCR法在临床效果上较细菌培养法好，利于在临床推广应用。

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1003—6350（2015）14—2164—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.14.0781

2015-01-09)

邓石雄。E-mail：shixiongd@163.com