布比卡因对高糖培养SH-SY5Y 细胞毒性研究＊

李亚文，徐世元，张庆国，李 乐，赖露颖，郑 艇，苏娇玲，杨耐梅，李元涛

（1.南方医科大学珠江医院麻醉科，广州510282；2.南方医科大学附属深圳妇幼保健院麻醉科，广东深圳518028）

研究证实糖尿病患者接受椎管内阻滞麻醉或镇痛后，其发生神经损伤的风险明显增加，或加重原有多发性神经病变。而产妇妊娠期糖尿病发生率呈增高趋势［1］，此类患者可能类同于糖尿病患者，采用椎管内阻滞麻醉或镇痛可增加神经损伤的风险，但神经损伤因素、机制及其与局部麻醉药的关系尚未明确。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）与糖尿病代谢紊乱有关。妊娠期糖尿病母体高血糖状态内源性活性氧（ROS）生成增加，损伤细胞抗氧化能力，导致氧化应激。在糖尿病病理状态下，不同组织（包括神经）均可产生ROS，长期过量ROS积累引起慢性氧化应激，引起神经组织毒副作用。因此本研究在高糖环境下培养SH-SY5Y 细胞，建立高糖细胞损伤模型，加入布比卡因，研究ERS细胞内ROS产量与细胞凋亡，探讨高糖环境与布比卡因神经毒性作用的关系。目的在于为解决妊娠期糖尿病局部麻醉药神经毒性防治提供理论依据，而有关这方面的研究目前尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM／F12培养基、DMEM 低糖培养基、胎牛血清（Gibco公司，美国），SHSY-5Y 细胞株（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心），酶标仪（Bio-Tek公司，美国），倒置荧光显微镜（Nikon 公司，日本），流式细胞仪（FCM，Becton Dickinson公司，美国），BG-Power600i电泳仪（百晶生物技术公司，北京），暗匣（粤华医疗器械厂，汕头），聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Millipore公司，德国），高速离心机（Eppendorf公司，德国），超净工作台（苏州医疗器械厂，苏州）

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 （1）从液氮罐中取出含有细胞的冻存管，立即置于37 ℃水浴中，轻轻摇动，使其尽快融化；（2）从水浴中取出冻存管，用乙醇消毒后打开，用吸管吸出细胞悬液，加入10 mL含15%胎牛血清的DMEM／F12培养液，置于离心管中混合后，1 000r／min离心5min；（3）弃上清，再重复用培养液洗1次；（4）用培养液重悬细胞，接种至25cm2培养瓶，置37 ℃、5%CO2培养箱培养，次日更换培养液，以后每2天换液1次；（5）当细胞将要长满瓶底时，弃培养液，加入少量的胰蛋白酶细胞消化液消化数分钟后，在倒置显微镜下观察细胞状态。当细胞变圆时，立即加入含15%胎牛血清的DMEM／F12培养液中和消化液，用吸管轻轻吹打，吸出细胞，计数，接种于新的培养瓶或培养板中。

1.2.2 细胞内ROS产量变化检测 将SH-SY5Y 细胞按5×105／孔接种于4个6孔培养板。设立对照（5.56mmol／L）、阳性（6.10、7.00、7.80、11.10、13.30 mmol／L）、阴 性（仅 加 培 养基）和空白组（反加PBS）。其中两板培养1d后各孔换各自含糖液继续培养1d。其余两板培养1d后各孔换各自含糖液继续培养过夜，再经含1 mmol／L 布比卡因培养液培养6h。消化细胞，EP管收集，1 000r／min离心5min，去上清。按照1∶1 000 用PBS 液稀释荧光探针DCFH-DA，使其终浓度为10 μL／L。去除细胞培养液，加入适量DCFH-DA 于有培养液的各孔，37℃细胞培养箱内孵育20min，用PBS液洗细胞3次以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。重悬细胞。FCM 检测细胞内荧光强度。

1.2.3 FCM 检测细胞凋亡 消化SH-SY5Y 细胞，制单细胞悬液，细胞计数调整浓度至5×105／mL；将细胞接种至两个24孔培养板，每孔加入500μL。将培养板放入37℃、5%CO2培养箱内培养1d。各组细胞更换各自含糖液继续培养1d。将其中一板吸净培养基，用含1 mmol／L 布比卡因培养基培养6h。各组细胞用PBS缓冲液洗涤2次，收集细胞至1.5 mL离心管并用500μL Binding buffer重悬细胞。在每管细胞加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，避光室温下孵育5min后用FCM 检测。

1.2.4 Western blot检测GRP78表达水平 消化SH-SY5Y细胞，制单细胞悬液，细胞计数调整浓度至5×105／mL；细胞接种至两个6孔培养板，每孔加入1 000μL。其中一块培养板放入37 ℃、5%CO2培养箱内培养1d。各组细胞更换各自含糖液继续培养2d。将另一块培养板放入37 ℃、5%CO2培养箱内培养1d。各组细胞更换各自含糖液继续培养1d。吸净培养基，每孔加入1mmol／L布比卡因，放入37℃、5%CO2培养箱内孵育6h。然后进行蛋白样品制备、电泳、转膜、免疫反应、ECL反应及曝光、显影、凝胶图像分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行数据分析。计量资料以±s表示，ROS水平和细胞凋亡率采用两因素析因设计资料方差分析，组间比较采用LSD 法（方差齐）或Dunnett′s T3法（方差不齐）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 布比卡因作用前、后细胞内ROS产量比较 当葡萄糖浓度分别为5.56、6.10、7.00、7.80、11.10、13.30mmol／L 时，布比卡因作用前、后细胞内ROS产量依次为308±12、454±11、526±18、603±45、905±18、653±287 和361±12、478±33、583±68、733±34、984±20、1 571±162。布比卡因作用前、后5.56、7.80、11.10、13.30 mmol／L 组内比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。6.10、7.00 mmol／L 组内比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明布比卡因作用前、后随着葡萄糖浓度升高，ROS产量亦随之增加。

2.2 布比卡因作用前、后细胞凋亡比较 当葡萄糖浓度分别为5.56、6.10、7.00、7.80、11.10、13.30mmol／L 时，布比卡因作用前、后细胞凋亡率依次为0.014±0.001、0.017±0.001、0.026±0.001、0.029±0.001、0.047±0.001、0.050±0.002和0.018±0.001、0.028±0.001、0.033±0.002、0.043±0.002、0.063±0.001、0.079±0.002。布比卡因作用前、后组内比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明布比卡因作用前、后随着葡萄糖浓度升高，细胞凋亡亦随之增加。

2.3 布比卡因作用前、后细胞GRP78表达量 当葡萄糖浓度分别为5.56、6.10、7.00、7.80、11.10、13.30mmol／L 时，布 比卡因作用前、后细胞GRP78 表达量依次为1.20±0.15、0.88±0.04、0.97±0.05、0.83±0.04、0.94±0.05、0.26±0.06和1.02±0.12、0.97±0.06、0.49±0.04、0.46±0.06、0.22±0.03、0.15±0.07。5.56mmol／L、6.10mmol／L、13.30 mmol／组内比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。7.00、7.80 mmol／L、11.10 mmol／L组内比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明低糖环境可诱导细胞GRP78表达，随着葡萄糖浓度进一步升高，GRP78表达量剧降；布比卡因作用下，低糖环境抑制细胞GRP78表达，正常血糖范围内，细胞产生稳定量的GRP78较低糖环境下低。随着葡萄糖浓度进一步升高，GRP78产量剧降。

3 讨 论

高糖环境下局部麻醉药神经毒性机制的研究报道甚少。妊娠期糖尿病为一类特有糖尿病，不同于原发性Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。但两者特点之一为ERS与糖尿病代谢紊乱有关［2］。

布比卡因作用前、后随着葡萄糖浓度升高，ROS产量随之增加，细胞凋亡亦随之增加。说明SH-SY5Y 细胞在代谢刺激下内质网功能发生变化。内质网具有较强的内稳态体系，可仍然有很多因素导致内质网功能内稳态失衡，形成ERS。能量和营养过剩激发ERS［3-4］，细胞器代谢负荷过重和线粒体功能障碍产生ROS。高糖环境激活细胞半胱氨酸酶活性，导致乳酸脱氢酶泄漏，细胞毒性增加［5］。布比卡因使细胞ERS明显增强，ROS产量增多［6］，细胞毒性增加，细胞凋亡增多。

ERS反应是一种细胞水平上的保护性手段。GRP78表达增加提高细胞抵御应激的能力。GRP78在正常细胞内呈低水平表达［7］，保护细胞免受应激因素所导致的凋亡［8］。低糖环境诱导细胞GRP78表达，随着葡萄糖浓度进一步升高至正常血糖浓度范围，GRP78 产量降低；葡萄糖浓度继续增高，细胞GRP78表达再次升高。但随着糖浓度极度增加，ERS增强致氧化，代谢、转化负荷过重，ROS在细胞内毒性积累，细胞发生凋亡，表现为GRP78表达降低。细胞ERS增强和（或）自身修复机制启动GRP78合成以维持细胞生存，此时表现为GRP78表达呈一定程度增加。ERS后期细胞凋亡增多，GRP78产量急剧下降。本实验还说明正常血糖浓度是神经细胞生长和局部麻醉药神经毒性损伤恢复所需最适宜环境［9-15］。

虽然本细胞模型尽量模仿临床实际情况，但还有许多局限性。人体神经细胞所处体内环境复杂，而在实验中仅考虑高糖环境这一独立因素对SH-SY5Y 细胞的影响。下一步研究方向是在整体动物实验和临床受试人群水平研究高血糖环境对局部麻醉药神经毒性的影响。随着对ERS与局部麻醉药神经毒性关系的深入研究，将能更好理解局部麻醉药神经毒性分子机制，为治疗局部麻醉药神经毒性提供新的治疗靶点和寻找新的治疗途径。

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