致病性曲霉的耐药性研究进展

王千，李若瑜，刘伟

北京大学第一医院皮肤性病科，北京大学真菌与真菌病研究中心，皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京 100034

致病性曲霉的耐药性研究进展

王千，李若瑜，刘伟

北京大学第一医院皮肤性病科，北京大学真菌与真菌病研究中心，皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京 100034

随着抗真菌药物在临床上的广泛使用，致病性真菌的耐药率越来越高，耐药曲霉对侵袭性曲霉病的诊治产生了重要影响。目前，致病性曲霉耐药性的确定主要依靠抗真菌药敏试验和分子诊断。在有关曲霉耐药机制的研究中，报道最多的是曲霉对唑类药物的耐药，其机制主要包括外排泵表达增加、靶酶Cyp51突变和表达水平增高、形成生物膜，以及热休克蛋白90(Hsp90)介导的信号通路参与而导致的耐药。本文就上述领域近年来的主要进展进行综述。

曲霉;耐药;唑类抗真菌药物

近年来，随着实体器官移植和骨髓移植的开展、糖皮质激素的应用等，免疫受损个体不断增多。同时，由于抗生素的大量使用引起体内菌群失调，导致侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis)的发病率不断上升。80%的侵袭性曲霉病由烟曲霉(Aspergillus fumigatus)引起，15% ～20%由黄曲霉引起，少数由黑曲霉和土曲霉引起［1］。

目前治疗侵袭性曲霉病的药物主要有4类:多烯类，如两性霉素B;三唑类，如伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑;棘白菌素类，如卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净［2］;烯丙胺类，如特比萘芬。虽然侵袭性曲霉病的诊断和治疗水平不断提高，但其病死率仍很高，耐药菌株的出现是导致治疗失败的重要原因，感染耐唑类曲霉的侵袭性曲霉病患者病死率高达88%［3］。因此，对曲霉的耐药性进行早期诊断、研究曲霉的耐药机制有利于检测和控制耐药曲霉病的发生。现就有关致病性曲霉的耐药性进展作一简要综述。

1 抗真菌药敏试验及曲霉耐药菌株的确定

可靠的药敏试验能指导临床合理选择抗真菌药物及监测临床疗效。目前临床上使用的药敏试验方法主要包括肉汤常量和微量稀释法、琼脂扩散法、纸片扩散法和E-test法。这些技术在费用、重复性、方法之间的兼容性及结果的解释方面均有所不同［4］。

致力于提高体外药敏试验的可重复性和客观性，美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)于2008年推出了针对丝状真菌敏感试验的标准化方法M38-A2，欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)也推出了针对丝状真菌药敏试验的标准化方法E.DEF.9.1。这些药敏试验方法的标准化对确定致病性曲霉的耐药菌株具有重要意义。同时，有学者建议使用微量稀释法确立唑类药物对烟曲霉的判读折点:当伊曲康唑和伏立康唑的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)＜2 mg/L时为敏感，MIC=2 mg/L为中介，MIC＞2 mg/L为耐药;对于泊沙康唑，MIC＜0.25 mg/L、0.25＜MIC＜0.5 mg/L和MIC＞0.5 mg/L分别为敏感、中介和耐药［5］。更多的多烯类和棘白菌素类药敏终点判定的标准化工作正在进行，判读折点和药敏试验的具体方法还有待进一步确定。

2 曲霉耐药的分子诊断

曲霉耐药的分子诊断方法:通过设计引物，利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)特异扩增曲霉基因组(包含待检测突变位点的基因序列)，随后将其与包含突变位点的阳性序列进行比对，判断该曲霉是否发生了特定位点突变导致的耐药［6］。目前，烟曲霉对唑类药物耐药的分子诊断方法主要是检测cyp51A基因中的突变。PCR的模板DNA多来源于临床菌株培养后收集、提取的基因组DNA［7］。

但Spiess等利用改良PCR，可直接将送检标本中提取的DNA作为模板，对目的基因进行PCR扩增，检测cyp51A中的突变热点及启动子区插入的重复序列。目前可检测的耐药突变位点包括M220、TR34［8］、L98H［9］和TR46［6］。

3 耐药机制

3.1 对多烯类药物耐药

多烯类抗真菌药物通过与真菌细胞膜上的麦角固醇直接结合，造成细胞膜对单价和二价阳离子的通透性增加，最终导致细胞死亡。目前用于治疗侵袭性曲霉病的多烯类药物主要包括两性霉素B脱氧胆酸(D-AMB)及其含脂制剂(LFAB)(如两性霉素B脂质复合体、两性霉素B脂质体和两性霉素B胶质分散体)。其中D-AMB可用于侵袭性曲霉病的初始治疗［2］。

在曲霉属中，除土曲霉对两性霉素B天然耐药外，其继发耐药较少见，偶可发生于严重免疫抑制患者。关于致病性曲霉是否对多烯类药物产生耐药性，CLSI的M38-A2方案并没有对两性霉素B体外药敏试验MIC判读的折点作出明确规定。但有研究表明，体外药敏试验中对两性霉素 B MIC≥2 mg/L的菌株，在感染动物模型中对两性霉素B的治疗无反应［10］。此外，有学者利用药代-药效模型模拟体内两性霉素B的血药浓度，确立了两性霉素B对烟曲霉的判读折点:MIC≤0.5 mg/L、0.5＜MIC＜2 mg/L和≥2 mg/L分别表示敏感、中介和耐药［11］。

曲霉对两性霉素B耐药的机制目前尚不明确，而土曲霉对两性霉素B天然耐药。以前有研究认为，细胞膜麦角固醇减少是导致土曲霉对唑类药物耐药的重要因素［12］。然而，Blum等通过比较两性霉素B耐药土曲霉与敏感土曲霉，发现两者细胞壁中麦角固醇的含量无显著差异，但耐药株胞内药物浓度低于敏感株，且抗氧化水平更好，表明麦角固醇的含量减少并非耐药的主要影响因素［13］。

3.2 对唑类药物耐药

唑类药物通过抑制麦角固醇合成途径中的细胞色素P450 14α-去甲基酶(Cyp51)，引起羊毛固醇积聚及麦角固醇缺乏，使真菌细胞膜合成受阻，从而导致真菌细胞破裂而死亡。唑类药物包括氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑等，后三者目前均可用于侵袭性曲霉病治疗。根据2008年美国感染病学会(Infectious Diseases Society of America，IDSA)公布的曲霉病治疗指南，伏立康唑被推荐为治疗侵袭性曲霉病的首选药物，伊曲康唑可用于补救治疗，泊沙康唑可用于粒细胞缺乏、白血病或骨髓增生异常综合征患者，以及发生移植物抗宿主病的同种异体造血干细胞移植受者等易发生曲霉病高危患者的预防治疗。欧洲尚批准泊沙康唑用于伊曲康唑治疗无效的侵袭性曲霉病［2］。

1997年Denning首次描述了烟曲霉对伊曲康唑产生耐药性［14］。之后，有关耐唑类药物的烟曲霉菌株报道增多，且部分菌株对伏立康唑等唑类药物交叉耐药。可以预测，致病性曲霉对唑类药物的耐药性将对侵袭性曲霉病治疗药物的选择产生重要影响。目前，已知致病性曲霉对唑类药物的耐药机制主要有以下几种。

3.2.1 药物外排机制外排泵基因过表达使外排泵作用增强，细胞内唑类药物含量减少导致烟曲霉耐药。烟曲霉药物外排泵包括两类:一是ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)蛋白，二是主要协助转运蛋白超家族(major facilitator superfamily，MFS)。基因组分析显示，烟曲霉基因组中包含49个ABC转运蛋白编码基因和278个MFS转运蛋白编码基因［15，16］。2002年Slaven等首次克隆了烟曲霉中的外排泵基因atrf，并用斑点杂交方法证实了伊曲康唑耐药株中atrf表达量是敏感株的5倍［17］。最近，Fraczek等对曼彻斯特地区的耐药曲霉进行分析，发现＞50%的耐药菌株无cyp51A或启动子区突变，并对非cyp51A突变的耐药机制进行了研究。研究表明，外排泵基因cdr1B过表达与耐唑类药物有关［18］，但仍需开展大规模的基因过表达分析及基因敲除研究，以确定影响药物外排泵基因表达的信号转导通路和转录因子在耐药发生中的作用。

3.2.2 cyp51A基因突变Cyp51是唑类药物的作用靶点，烟曲霉中唑类药物靶酶的编码基因有cyp51A和 cyp51B，黄曲霉中有 cyp51A、cyp51B和cyp51C，目前已明确烟曲霉的cyp51A突变与对唑类药物的耐药性密切相关。研究表明，烟曲霉cyp51A基因突变引起的靶酶Cyp51中G138和G448氨基酸替换导致其对伏立康唑和伊曲康唑耐药;M220和G54的氨基酸替换能导致对伊曲康唑和泊沙康唑耐药;M236的氨基酸替换能导致对伊曲康唑耐药［5］。

2007年，荷兰科学家发现很多侵袭性曲霉病患者(包括未使用过唑类药物治疗的原发患者)感染了对唑类药物交叉耐药的曲霉菌株，并发现其耐药机制主要是由于TR34/L98H，即cyp51A基因启动子区34 bp串联重复序列插入及编码区98位亮氨酸突变为组氨酸［19］。2007～2011年，有6个欧洲国家(英国、西班牙、比利时、丹麦、法国和挪威)相继报道了 TR34/L98H类型耐药菌株。2012～2013年，更多国家报道了TR34/L98H耐药菌株，其中包括来自德国的首次报道和法国的后续报道。关于原发耐药菌株的来源，有学者利用基因标记技术检测了142株欧洲分离的耐药菌株，发现TR34/L98H菌株的基因变异比敏感株或其他耐药机制的菌株少。这表明欧洲的TR34/L98H耐药株有共同的祖先，可能是在荷兰，以后迁移至整个欧洲。相反，印度的TR34/L98H菌株(包括环境株和临床分离株)均有相同的微卫星基因型，但这种基因型未在其他区域发现，推测可能是唑类耐药菌株与印度本土菌株杂交的结果［20］。

最近有学者在荷兰报道了cyp51A基因启动子区46 bp串联重复序列插入和编码区121位、289位氨基酸替换(TR46/Y121F/T289A)的突变类型，可导致烟曲霉对伏立康唑耐药［21］。随后比利时学者也报道了这种基因型，表明其有地理上的扩散［22］。本课题组新近确定，烟曲霉TR34/L98H菌株合并出现基因突变所致的T248N和L307P介导了对伏立康唑和伊曲康唑的交叉耐药［23］。另外，还在国际上首次确定cyp51C的T788G错义突变可导致黄曲霉对伏立康唑耐药［24］。

3.2.3 热休克蛋白90热休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)是一种常见的分子伴侣。研究表明，Hsp90可通过依赖钙调磷酸酶(calcineurin)途径调节细胞内的信号转导，主要参与假丝酵母(又称念珠菌)对唑类、曲霉对棘白菌素类药物的适应性反应，使真菌出现快速耐药。Cowen等通过构建Hsp90表达量不同的菌株Lo90(低)、Re90(中)和Hi90(高)进行实验，发现胞内Hsp90含量与真菌耐药性有关，含量越高耐药性越强，如果Hsp90缺失，耐药性也随之消失;Hsp90对基因组各类突变及Erg3介导的耐药性都是必需的［25］;耐药性一旦出现，则菌株对Hsp90不再具有依赖性［26，27］。Hsp90抑制剂格尔德霉素联合卡泊芬净或他克莫司对唑类耐药菌株有杀菌作用［28］。此外，Hsp90的赖氨酸残基去乙酰化对Hsp90活化具有重要意义，赖氨酸去乙酰化酶(lysine deacetylase，KDAC)抑制剂可阻断Hsp90活化，从而抑制耐药性出现并增加曲霉的敏感性［29］。

此外，Hsp90可能还通过调节其他信号途径来介导真菌对各种压力的反应［25］，是一种新型抗真菌药物的作用靶点。

3.2.4 曲霉生物膜的形成生物膜是由细胞外多聚基质包裹的菌丝相互黏附构成的有结构的微生物群落，是相对于游离状态菌而言的微生物另一种存在方式。本课题组研究表明，烟曲霉可形成生物膜［30］，曲霉生物膜可通过药物外排泵基因和唑类靶酶基因的表达量升高而对药物产生耐药［31］，棘白菌素类药物与唑类药物或两性霉素B联用可发挥对曲霉生物膜的协同杀伤作用［32］。

3.3 对棘白菌素类药物耐药

棘白菌素类药物作用于真菌细胞壁，通过抑制1，3-β-D-葡聚糖合成酶，影响真菌细胞壁合成，使真菌生长过程中细胞壁葡聚糖缺乏、渗透压失常而最终导致细胞溶解［2］。目前临床常用的棘白菌素类药物有卡泊芬净、米卡芬净及阿尼芬净。

2008年，Eschertzhuber从1例心脏移植术后并发侵袭性曲霉病患者体内分离出1株耐卡泊芬净黄曲霉［33］。目前，耐棘白菌素类曲霉仍少见。Rocha等通过研究从实验室分离获得的耐卡泊芬净烟曲霉，发现其耐药机制主要是由于编码葡聚糖合成酶的基因fks1突变引起678位氨基酸替代(S678P)，导致卡泊芬净、阿尼芬净、米卡芬净的最低有效浓度(minimal effect concentration，MEC)升高至 16 mg/L［34］。

此外，Lewis等利用感染了烟曲霉野生株和AfFKS1突变株(S678P)的中性粒细胞减少的小鼠模型，发现卡泊芬净、阿尼芬净的给药量每日＞0.5 mg/kg时能有效降低野生株负荷，但只有当卡泊芬净给药量每日＜1 mg/kg、阿尼芬净给药量每日＞4 mg/kg时才能有效降低突变株负荷，证实Fks1中S678P突变导致菌株耐药［35］。

但对临床耐棘白菌素类曲霉的耐药机制，由于缺乏临床耐药菌株而未能进行更深入的研究和报道。

3.4 对烯丙胺类药物耐药

烯丙胺类抗真菌药物通过抑制真菌的角鲨烯环氧化酶阻断真菌细胞麦角固醇的合成，进而破坏其细胞膜的生成。虽然烯丙胺类药物主要用于浅部真菌病的治疗，但有证据表明真对侵袭性曲霉病也有一定的疗效15〛。代表药物有萘替芬、特比萘芬、布替萘芬等。有关特比萘芬耐药的报道较少，但有研究表明，烟曲霉角鲨烯环氧化酶编码基因ergA突变使389位氨基酸被替代(F389L)，可导致烟曲霉对特比萘芬耐药［36］。另外，靶酶基因拷贝数增加也可导致烟曲霉对特比萘芬耐药［37］。

4 结语

目前临床上治疗侵袭性曲霉病的首选药物是唑类，但耐唑类菌株的出现使其在临床上的应用受到限制。因此，建立标准化的药敏试验手段，开展分子诊断方法，深入研究致病性曲霉的耐药机制，将有利于抗真菌药物的合理使用和控制真菌耐药的发生。

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The progress in antifungal resistance of pathogenic Aspergillus spp.

WANG Qian，LI Ruo-Yu，LIU Wei
Department of Dermatology，Peking University First Hospital，Research Center for Medical Mycology，Beijing Key Laboratory of Molecular Diagnosis on Dermatoses，Peking University，Beijing 100034，China

With the wide use of antifungals in the clinic，there have been increasing reports of resistant strains of Aspergillus spp.to antifungals.The resistance of Aspergillus spp.has important impact on the diagnosis and treatment of invasive aspergillosis.Currently，the determination of antifungal resistance of pathogenic Aspergillus spp.relies on antifungal susceptibility testing and molecular detection.Recently，the resistance of Aspergillus spp.to antifungals is mainly focused on azole antifungals.The research progress on antifungal resistance of pathogenic Aspergillus spp.，including the diagnosis for resistance and the molecular mechanisms，such as over-expression of efflux pumps，mutations in the target enzyme(Cyp51)，formation of biofilm and heat shock protein 90(Hsp90)-mediated signaling pathways are reviewed.

Aspergillus spp.;Drug resistance;Azole antifungals

.LIU Wei，E-mail:liuwei@bjmu.edu.cn

2014-11-18)

国家自然科学基金(81471925)，教育部“新世纪人才支持计划”(NCET-10-0198)

刘伟